本文關(guān)鍵詞：抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 鮑曼不動(dòng)桿菌屬于非發(fā)酵革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然界中,屬條件致病菌,在醫(yī)院的環(huán)境中分布廣泛且可長(zhǎng)期存活。以引起呼吸道感染為主,也可引發(fā)菌血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎、手術(shù)部位感染、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等。醫(yī)療環(huán)境中的氧氣濕化瓶、呼吸機(jī)、輸液設(shè)備、空調(diào)系統(tǒng)以及病人和醫(yī)務(wù)人員皮膚均可被此菌污染而引起患者感染。對(duì)在院患者及醫(yī)護(hù)人員有很大的威脅,尤其是對(duì)重癥監(jiān)護(hù)病房和燒傷病房中的患者,因其抵抗力低下或者皮膚大面積缺失等,成為了細(xì)菌侵襲機(jī)體的主要因素。 近年來(lái),隨著鮑曼不動(dòng)桿菌醫(yī)院感染率、檢出率及臨床分離率的逐年上升,其耐藥性亦呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。甚至出現(xiàn)了廣泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,給臨床治療帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。研究表明：鮑曼不動(dòng)桿菌基因組的特性使其具有快速獲得和傳播耐藥性的能力,近年來(lái)多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌呈廣泛流行傳播。 臨床上對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌感染的治療,常常束手無(wú)策。因?yàn)轷U曼不動(dòng)桿菌不僅對(duì)常用的阿米卡星、環(huán)丙沙星、妥布霉素、慶大霉素的耐藥率均高達(dá)95%以上,而且對(duì)第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率亦可高達(dá)70%。雖然部分鮑曼不動(dòng)桿菌菌株對(duì)亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮-舒巴坦和多粘菌素仍有一定的敏感性,但隨著抗菌藥物大量而且廣泛使用,耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株也越來(lái)越多,耐藥率也逐年上升。目前,雖然對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制尚不完全明確,但近年來(lái)關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制的報(bào)道越來(lái)越多,大多數(shù)研究均表明,鮑曼不動(dòng)桿菌的主要致病因素與其產(chǎn)生的生物膜有關(guān)。 細(xì)菌生物膜是一個(gè)具有結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性和功能性的高度組織群體,其相關(guān)感染因?yàn)閷?duì)抗生素的耐藥性極強(qiáng)成為臨床難治性感染的重要原因之一。幾乎每一種細(xì)菌都可以以生物膜的形式存在,國(guó)外相關(guān)研究證實(shí)至少65%的人類細(xì)菌感染疾病與生物膜有關(guān)。慢性中耳炎、中耳膽脂瘤、慢性腺樣體炎等疾病的發(fā)病原因已被證實(shí)與生物膜的形成有關(guān)。生物膜是由多個(gè)細(xì)菌不可逆地黏附于機(jī)體或物體表面,被自身分泌的基質(zhì)包裹,形成細(xì)菌群落。相比游離狀態(tài)的細(xì)菌,細(xì)菌生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性明顯降低,這可能與生物膜的結(jié)構(gòu)或者是細(xì)菌生物膜內(nèi)的細(xì)菌生理結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變有關(guān),使得生物膜外的抗菌藥物難以進(jìn)入生物膜深部。以前一直認(rèn)為是由于生物膜介導(dǎo)才使得抗菌藥物難以滲透到生物膜內(nèi)部,但一些研究否認(rèn)了這一假說(shuō)。研究表明,喹諾酮類藥物能迅速滲透到綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部,四環(huán)素能迅速滲透入大腸桿菌生物膜內(nèi)部,萬(wàn)古霉素能迅速滲透入金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)部。目前能確認(rèn)的只有氨基糖苷類藥物,因?yàn)樯锬せ|(zhì)帶負(fù)電荷,而氨基甙類藥物帶正電荷,因此,其很難滲入生物膜內(nèi)部。此外,由于許多抗菌藥物對(duì)繁殖期的細(xì)菌有很強(qiáng)的殺滅作用,如青霉素類藥物、頭孢菌素類藥物及其一些碳青霉烯類藥物等。由于受氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的匱乏及密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等的影響,使得生存于細(xì)菌生物膜內(nèi)部的細(xì)菌,生長(zhǎng)、繁殖率下降,從而影響抗菌藥物對(duì)其作用。因此,在抗菌藥物的作用下,細(xì)菌生物膜內(nèi)相對(duì)敏感的細(xì)菌可能會(huì)被殺死,但耐藥性強(qiáng)的細(xì)菌會(huì)繼續(xù)存在,而且一旦停止使用抗菌藥物,這些耐藥細(xì)菌會(huì)重新繁殖、生長(zhǎng)。細(xì)菌生物膜使細(xì)菌具有極高的耐藥性和免疫逃逸能力,可以逃避機(jī)體的免疫攻擊和抗生素的殺滅,并進(jìn)一步成為耐藥菌,這也是是導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染以及感染難以治愈的重要原因。所以,尋求一種從根本上控制、解決細(xì)菌感染和耐藥的藥物,對(duì)每一個(gè)臨床工作者來(lái)說(shuō),是十分重要的。 隨著分子生物學(xué)理論及基因工程技術(shù)的發(fā)展,探索一種廣譜、無(wú)耐藥性或者低耐藥性的新型抗菌藥物越來(lái)越受到人們的重視�？咕氖窃趧�(dòng)物主動(dòng)防御體系中發(fā)現(xiàn)的一種多肽,由宿主基因編碼,是動(dòng)物固有免疫的重要成分。抗菌肽是生物體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的一類小分子活性多肽,是生物體內(nèi)固有免疫的重要組成部分,這類活性多肽多數(shù)具有熱穩(wěn)定性、酸堿適應(yīng)性及廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)及腫瘤細(xì)胞等特點(diǎn),主要分布于細(xì)菌、病毒、各種動(dòng)物和植物體內(nèi)。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)表明,LL-37是迄今在人體發(fā)現(xiàn)的Cathelicidins家族的唯一成員,hCAP-18酶解后釋放出的C端片段,成為L(zhǎng)L-37,因其N端前兩個(gè)氨基酸殘基為亮氨酸(L)和氨基酸殘基總數(shù)為37而得名。LL-37在人體組織中廣泛存在,這類活性多肽主要由中性粒細(xì)胞、各種上皮細(xì)胞等產(chǎn)生,具有熱穩(wěn)定性、酸堿適應(yīng)性,能抗菌、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、趨化作用、血管生成的刺激作用及組織再生和細(xì)胞因子釋放。相關(guān)研究證實(shí)了抗菌肽LL-37對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、腸球菌以及金葡菌具有抑菌作用,而且對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生的生物膜也有一定的破壞作用。但是關(guān)于抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜作用的實(shí)驗(yàn)研究尚未多見(jiàn)。本文旨在研究LL-37對(duì)浮游性鮑曼不動(dòng)桿菌及其生物膜的影響,為將來(lái)在臨床感染的控制和新的抗菌藥物的研發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。 研究目的 1、觀察鮑曼不動(dòng)桿菌形成生物膜的能力,探索在體外建立鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜模型的方法； 2、檢測(cè)抗菌肽LL-37的MIC； 3、觀察抗菌肽LL-37對(duì)浮游型鮑曼不動(dòng)桿菌及其生物膜的影響。 研究方法 1、生物膜形成的定性測(cè)定：在24孔組織培養(yǎng)板上建立鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜預(yù)模型。挑取AB菌落于5ml LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)。8小時(shí)后用比濁儀調(diào)整菌液濃度約為1.0×108CFU/ml,吸取200gl菌液加入已加12x12mm玻片24孔板,每孔內(nèi)加入2ml LB培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng),每24h更換培養(yǎng)液1次,5d后將蓋玻片從培養(yǎng)基中移除,用無(wú)菌PBS輕洗3次,以除去附著的浮游菌,加熱固定后用結(jié)晶紫染色觀察。培養(yǎng)孔中的浮游菌做結(jié)晶紫染色觀察。 2、測(cè)定LL-37MIC:根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)所制定方法測(cè)定MIC。 3、LL-37對(duì)生物膜作用 (1)掃描電鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)將無(wú)菌吸痰管剪成1.0cm大小,高壓滅菌后置于含上述菌液的24孔板中,37℃恒溫培養(yǎng)5d,每24小時(shí)更換培養(yǎng)液。5d后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組加入20μg/ml LL-37溶液,對(duì)照組加無(wú)菌雙蒸水。24小時(shí)后用無(wú)菌PBS溶液輕輕漂洗數(shù)次,2.5%戊二醛溶液固定,置冰箱4℃保存。經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水后,將樣品放入臨界點(diǎn)干燥器內(nèi),干燥后的標(biāo)本放入高真空蒸發(fā)器中,離子噴濺儀噴金后待測(cè)。運(yùn)用掃描電子顯微鏡觀察硅膠膜上鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的超微結(jié)構(gòu)。(2)結(jié)晶紫染色法定量檢測(cè)生物膜96孔板內(nèi)加入200μl菌液,每24小時(shí)換LB培養(yǎng)液,37℃恒溫培養(yǎng)；5d后在各孔內(nèi)分別加入不同濃度LL-37(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、(無(wú)菌雙蒸水),37℃恒溫放置24小時(shí)后,用無(wú)菌PBS溶液輕輕漂洗96孔板,自然風(fēng)干后,加入1%結(jié)晶紫溶液2ml,室溫染色20min,蒸餾水洗去染液,自然風(fēng)干后,加入95%乙醇,放置10min。用酶標(biāo)儀測(cè)定570nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值,以空白酒精做對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、在沒(méi)有外界因素誘導(dǎo)的條件下,鮑曼不動(dòng)桿菌在蓋玻片上培養(yǎng)5d后形成成熟的生物膜,經(jīng)結(jié)晶紫染色后肉眼可見(jiàn)玻片表面覆蓋有紫色致密物質(zhì),高倍鏡下觀察,可見(jiàn)細(xì)菌聚集生長(zhǎng),形成膜狀集落；培養(yǎng)基中的浮游菌經(jīng)革蘭染色后在高倍鏡下觀察,細(xì)菌成散在分布。 2、成功測(cè)得抗菌肽LL-37對(duì)浮游型鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC的值為64μg/ml。 3、(1)掃描電鏡圖片明確地觀察到鮑曼不動(dòng)桿菌可以黏附在硅膠吸痰管表面,并形成生物膜,證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌可以生物膜菌的方式生存,與黏附物接觸第5天形成成熟的生物膜,與以往報(bào)道3-5天相一致。并且可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組生物膜相比對(duì)照組結(jié)構(gòu)明顯稀疏。 (2)LL-37濃度為2.5μg/ml時(shí)吸光度明顯降低,即生物膜量較0μg/ml、1.25μg/ml組明顯減少,表明此濃度下LL-37即可抑制生物膜形成,并隨著LL-37濃度的增加吸光度逐漸降低。當(dāng)LL-37濃度增至10μg/ml、20μg/ml時(shí),兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論 1、鮑曼不動(dòng)桿菌在蓋玻片上培養(yǎng)5d后形成成熟的生物膜,與以往報(bào)道3-5d相一致,證明已成功建立體外鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜模型。 2、測(cè)得抗菌肽LL-37的最小抑菌濃度為64μg/ml,與之前研究結(jié)果4-64μg/ml一致。 3、當(dāng)抗菌肽LL-37濃度為2.5μg/m(遠(yuǎn)低于其最小抑菌濃度時(shí))即可破壞鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜結(jié)構(gòu)的濃度。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽LL-37 細(xì)菌生物膜 鮑曼不動(dòng)桿菌
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-24
• 材料與方法24-28
• 一、主要實(shí)驗(yàn)器材24
• 二、主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑24-25
• 三、實(shí)驗(yàn)方法25-28
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-33
• 1、鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜模型建立28-29
• 2、抗菌肽LL-37對(duì)浮游型鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC29-30
• 3、抗菌肽LL-37對(duì)成熟鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜的作用30-33
• 討論33-43
• 總結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 文獻(xiàn)綜述50-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 攻讀學(xué)位期間成果58-59
• 附錄59-60
• 致謝60-61

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽LL-37對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：377207