本文關(guān)鍵詞：抗菌肽LL-37對鮑曼不動桿菌生物膜作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 鮑曼不動桿菌屬于非發(fā)酵革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然界中,屬條件致病菌,在醫(yī)院的環(huán)境中分布廣泛且可長期存活。以引起呼吸道感染為主,也可引發(fā)菌血癥、泌尿系感染、繼發(fā)性腦膜炎、手術(shù)部位感染、呼吸機相關(guān)性肺炎等。醫(yī)療環(huán)境中的氧氣濕化瓶、呼吸機、輸液設(shè)備、空調(diào)系統(tǒng)以及病人和醫(yī)務(wù)人員皮膚均可被此菌污染而引起患者感染。對在院患者及醫(yī)護人員有很大的威脅,尤其是對重癥監(jiān)護病房和燒傷病房中的患者,因其抵抗力低下或者皮膚大面積缺失等,成為了細菌侵襲機體的主要因素。 近年來,隨著鮑曼不動桿菌醫(yī)院感染率、檢出率及臨床分離率的逐年上升,其耐藥性亦呈增長趨勢。甚至出現(xiàn)了廣泛耐藥鮑曼不動桿菌、全耐藥鮑曼不動桿菌,給臨床治療帶來了很大的挑戰(zhàn)。研究表明：鮑曼不動桿菌基因組的特性使其具有快速獲得和傳播耐藥性的能力,近年來多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動桿菌呈廣泛流行傳播。 臨床上對于鮑曼不動桿菌感染的治療,常常束手無策。因為鮑曼不動桿菌不僅對常用的阿米卡星、環(huán)丙沙星、妥布霉素、慶大霉素的耐藥率均高達95%以上,而且對第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率亦可高達70%。雖然部分鮑曼不動桿菌菌株對亞胺培南、美羅培南、頭孢哌酮-舒巴坦和多粘菌素仍有一定的敏感性,但隨著抗菌藥物大量而且廣泛使用,耐藥的鮑曼不動桿菌菌株也越來越多,耐藥率也逐年上升。目前,雖然對鮑曼不動桿菌的耐藥機制尚不完全明確,但近年來關(guān)于鮑曼不動桿菌耐藥機制的報道越來越多,大多數(shù)研究均表明,鮑曼不動桿菌的主要致病因素與其產(chǎn)生的生物膜有關(guān)。 細菌生物膜是一個具有結(jié)構(gòu)性、協(xié)調(diào)性和功能性的高度組織群體,其相關(guān)感染因為對抗生素的耐藥性極強成為臨床難治性感染的重要原因之一。幾乎每一種細菌都可以以生物膜的形式存在,國外相關(guān)研究證實至少65%的人類細菌感染疾病與生物膜有關(guān)。慢性中耳炎、中耳膽脂瘤、慢性腺樣體炎等疾病的發(fā)病原因已被證實與生物膜的形成有關(guān)。生物膜是由多個細菌不可逆地黏附于機體或物體表面,被自身分泌的基質(zhì)包裹,形成細菌群落。相比游離狀態(tài)的細菌,細菌生物膜內(nèi)的細菌對抗菌藥物的敏感性明顯降低,這可能與生物膜的結(jié)構(gòu)或者是細菌生物膜內(nèi)的細菌生理結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變有關(guān),使得生物膜外的抗菌藥物難以進入生物膜深部。以前一直認為是由于生物膜介導(dǎo)才使得抗菌藥物難以滲透到生物膜內(nèi)部,但一些研究否認了這一假說。研究表明,喹諾酮類藥物能迅速滲透到綠膿桿菌和肺炎克雷伯菌生物膜的深部,四環(huán)素能迅速滲透入大腸桿菌生物膜內(nèi)部,萬古霉素能迅速滲透入金黃色葡萄球菌生物膜內(nèi)部。目前能確認的只有氨基糖苷類藥物,因為生物膜基質(zhì)帶負電荷,而氨基甙類藥物帶正電荷,因此,其很難滲入生物膜內(nèi)部。此外,由于許多抗菌藥物對繁殖期的細菌有很強的殺滅作用,如青霉素類藥物、頭孢菌素類藥物及其一些碳青霉烯類藥物等。由于受氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)的匱乏及密度感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等的影響,使得生存于細菌生物膜內(nèi)部的細菌,生長、繁殖率下降,從而影響抗菌藥物對其作用。因此,在抗菌藥物的作用下,細菌生物膜內(nèi)相對敏感的細菌可能會被殺死,但耐藥性強的細菌會繼續(xù)存在,而且一旦停止使用抗菌藥物,這些耐藥細菌會重新繁殖、生長。細菌生物膜使細菌具有極高的耐藥性和免疫逃逸能力,可以逃避機體的免疫攻擊和抗生素的殺滅,并進一步成為耐藥菌,這也是是導(dǎo)致慢性持續(xù)性感染以及感染難以治愈的重要原因。所以,尋求一種從根本上控制、解決細菌感染和耐藥的藥物,對每一個臨床工作者來說,是十分重要的。 隨著分子生物學理論及基因工程技術(shù)的發(fā)展,探索一種廣譜、無耐藥性或者低耐藥性的新型抗菌藥物越來越受到人們的重視�？咕氖窃趧游镏鲃臃烙w系中發(fā)現(xiàn)的一種多肽,由宿主基因編碼,是動物固有免疫的重要成分。抗菌肽是生物體免疫防衛(wèi)系統(tǒng)產(chǎn)生的一類小分子活性多肽,是生物體內(nèi)固有免疫的重要組成部分,這類活性多肽多數(shù)具有熱穩(wěn)定性、酸堿適應(yīng)性及廣譜抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲及腫瘤細胞等特點,主要分布于細菌、病毒、各種動物和植物體內(nèi)。近年來的實驗表明,LL-37是迄今在人體發(fā)現(xiàn)的Cathelicidins家族的唯一成員,hCAP-18酶解后釋放出的C端片段,成為LL-37,因其N端前兩個氨基酸殘基為亮氨酸(L)和氨基酸殘基總數(shù)為37而得名。LL-37在人體組織中廣泛存在,這類活性多肽主要由中性粒細胞、各種上皮細胞等產(chǎn)生,具有熱穩(wěn)定性、酸堿適應(yīng)性,能抗菌、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、趨化作用、血管生成的刺激作用及組織再生和細胞因子釋放。相關(guān)研究證實了抗菌肽LL-37對大腸桿菌、綠膿桿菌、腸球菌以及金葡菌具有抑菌作用,而且對大腸桿菌產(chǎn)生的生物膜也有一定的破壞作用。但是關(guān)于抗菌肽LL-37對鮑曼不動桿菌生物膜作用的實驗研究尚未多見。本文旨在研究LL-37對浮游性鮑曼不動桿菌及其生物膜的影響,為將來在臨床感染的控制和新的抗菌藥物的研發(fā)提供科學的依據(jù)。 研究目的 1、觀察鮑曼不動桿菌形成生物膜的能力,探索在體外建立鮑曼不動桿菌生物膜模型的方法； 2、檢測抗菌肽LL-37的MIC； 3、觀察抗菌肽LL-37對浮游型鮑曼不動桿菌及其生物膜的影響。 研究方法 1、生物膜形成的定性測定：在24孔組織培養(yǎng)板上建立鮑曼不動桿菌生物膜預(yù)模型。挑取AB菌落于5ml LB培養(yǎng)液中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)。8小時后用比濁儀調(diào)整菌液濃度約為1.0×108CFU/ml,吸取200gl菌液加入已加12x12mm玻片24孔板,每孔內(nèi)加入2ml LB培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng),每24h更換培養(yǎng)液1次,5d后將蓋玻片從培養(yǎng)基中移除,用無菌PBS輕洗3次,以除去附著的浮游菌,加熱固定后用結(jié)晶紫染色觀察。培養(yǎng)孔中的浮游菌做結(jié)晶紫染色觀察。 2、測定LL-37MIC:根據(jù)臨床實驗室標準化協(xié)會所制定方法測定MIC。 3、LL-37對生物膜作用 (1)掃描電鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)將無菌吸痰管剪成1.0cm大小,高壓滅菌后置于含上述菌液的24孔板中,37℃恒溫培養(yǎng)5d,每24小時更換培養(yǎng)液。5d后隨機分為實驗組和對照組,實驗組加入20μg/ml LL-37溶液,對照組加無菌雙蒸水。24小時后用無菌PBS溶液輕輕漂洗數(shù)次,2.5%戊二醛溶液固定,置冰箱4℃保存。經(jīng)過乙醇梯度脫水后,將樣品放入臨界點干燥器內(nèi),干燥后的標本放入高真空蒸發(fā)器中,離子噴濺儀噴金后待測。運用掃描電子顯微鏡觀察硅膠膜上鮑曼不動桿菌生物膜的超微結(jié)構(gòu)。(2)結(jié)晶紫染色法定量檢測生物膜96孔板內(nèi)加入200μl菌液,每24小時換LB培養(yǎng)液,37℃恒溫培養(yǎng)；5d后在各孔內(nèi)分別加入不同濃度LL-37(20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、(無菌雙蒸水),37℃恒溫放置24小時后,用無菌PBS溶液輕輕漂洗96孔板,自然風干后,加入1%結(jié)晶紫溶液2ml,室溫染色20min,蒸餾水洗去染液,自然風干后,加入95%乙醇,放置10min。用酶標儀測定570nm波長處吸光度(A)值,以空白酒精做對照。 實驗結(jié)果 1、在沒有外界因素誘導(dǎo)的條件下,鮑曼不動桿菌在蓋玻片上培養(yǎng)5d后形成成熟的生物膜,經(jīng)結(jié)晶紫染色后肉眼可見玻片表面覆蓋有紫色致密物質(zhì),高倍鏡下觀察,可見細菌聚集生長,形成膜狀集落；培養(yǎng)基中的浮游菌經(jīng)革蘭染色后在高倍鏡下觀察,細菌成散在分布。 2、成功測得抗菌肽LL-37對浮游型鮑曼不動桿菌的MIC的值為64μg/ml。 3、(1)掃描電鏡圖片明確地觀察到鮑曼不動桿菌可以黏附在硅膠吸痰管表面,并形成生物膜,證實鮑曼不動桿菌可以生物膜菌的方式生存,與黏附物接觸第5天形成成熟的生物膜,與以往報道3-5天相一致。并且可見實驗組生物膜相比對照組結(jié)構(gòu)明顯稀疏。 (2)LL-37濃度為2.5μg/ml時吸光度明顯降低,即生物膜量較0μg/ml、1.25μg/ml組明顯減少,表明此濃度下LL-37即可抑制生物膜形成,并隨著LL-37濃度的增加吸光度逐漸降低。當LL-37濃度增至10μg/ml、20μg/ml時,兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)論 1、鮑曼不動桿菌在蓋玻片上培養(yǎng)5d后形成成熟的生物膜,與以往報道3-5d相一致,證明已成功建立體外鮑曼不動桿菌生物膜模型。 2、測得抗菌肽LL-37的最小抑菌濃度為64μg/ml,與之前研究結(jié)果4-64μg/ml一致。 3、當抗菌肽LL-37濃度為2.5μg/m(遠低于其最小抑菌濃度時)即可破壞鮑曼不動桿菌生物膜結(jié)構(gòu)的濃度。
【關(guān)鍵詞】：抗菌肽LL-37 細菌生物膜 鮑曼不動桿菌
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-24
• 材料與方法24-28
• 一、主要實驗器材24
• 二、主要實驗材料和試劑24-25
• 三、實驗方法25-28
• 實驗結(jié)果28-33
• 1、鮑曼不動桿菌生物膜模型建立28-29
• 2、抗菌肽LL-37對浮游型鮑曼不動桿菌的MIC29-30
• 3、抗菌肽LL-37對成熟鮑曼不動桿菌生物膜的作用30-33
• 討論33-43
• 總結(jié)43-44
• 參考文獻44-50
• 文獻綜述50-58
• 參考文獻55-58
• 攻讀學位期間成果58-59
• 附錄59-60
• 致謝60-61

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：抗菌肽LL-37對鮑曼不動桿菌生物膜作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：377207