發(fā)布時間：2017-05-18 21:16

  本文關(guān)鍵詞：三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白原核表達及免疫原性差異性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：嗜吞噬細胞無形體（Anaplasmaphagocytophilum）屬于立克次體目無形體科無形體屬，是一類直徑為0.2-1.0um的經(jīng)蜱傳播的嚴格細胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，主要引起人粒細胞無形體�。℉umanGranulocyticAnaplasmosis，HGA）。自20世紀90年代初于美國首次發(fā)現(xiàn)以來，澳洲、歐洲多國、韓國及我國先后均有報道，且近年來呈上升趨勢。2006年安徽蕪湖弋磯山醫(yī)院的人粒細胞無形體病院內(nèi)傳播感染事件是我國第一次報道的人粒細胞無形體病感染確診病例，也是世界范圍內(nèi)首次報導(dǎo)的人粒細胞無形體人傳人事件。由于該病的臨床多表現(xiàn)為急性不明原因發(fā)熱，肌肉痛，乏力，頭痛等類似病毒感染性疾病癥狀，臨床缺乏對該病的足夠認識，也缺乏相應(yīng)的快速診斷方法，因此該病及易發(fā)生誤診，嚴重時可導(dǎo)致多器官功能衰竭，甚至死亡。 為探索人源無形體不同分離株AnkA蛋白免疫原性是否存在差異，進一步揭示這些蛋白質(zhì)間可能存在結(jié)構(gòu)及免疫表位差異以及可能相關(guān)的與宿主細胞作用蛋白譜差異。首先利用DNAMAN軟件比對美國Webster株、斯洛文尼亞1567株和美國96HE58株人源無形體分離株AnkA蛋白氨基酸序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三株菌AnkA蛋白的一致性為90.2%，Webster株與96HE58株AnkA蛋白的一致性最高，為95.2%，1567株和96HE58株AnkA蛋白的一致性最低，為90.6%。對這三株無形體AnkA蛋白B淋巴細胞線性表位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)Webster株和96HE58株人分離株無形體AnkA蛋白抗原表位存在一個差異，而它們與1567株AnkA蛋白抗原表位預(yù)測結(jié)果差異較大。 我們對3株無形體不同ankA基因進行了原核表達，同時進行了免疫原性初步分析。利用PCR技術(shù)擴增了嗜吞噬細胞無形體Webster株，斯洛文尼亞1567株，美國96HE58株ankA基因部分序列，構(gòu)建pET-30a-AnkA表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導(dǎo)高效表達融合蛋白，經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定氨基酸序列，免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體。采用ELISA和Westernblot方法分析三株菌AnkA重組蛋白與免疫小鼠血清抗體相互間，以及與10種常見的立克次體目成員陽性抗體鼠血清間的免疫反應(yīng)。同時檢測三株菌AnkA重組蛋白與我國無形體病人血清抗體反應(yīng)性。結(jié)果表明表達的重組蛋白主要以可溶性形式存在，小鼠免疫獲得高效價抗AnkAIgG抗體，三株菌重組蛋白免疫抗體之間存在免疫交叉性，與立克次體目成員間存在免疫交叉性。三株菌重組蛋白與我國無形體病人血清抗體存在免疫反應(yīng)。 本研究成功原核表達并純化了三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白，重組蛋白與我國無形體病人陽性血清存在免疫反應(yīng)。三株嗜吞噬細胞無形體AnkA重組蛋白與免疫小鼠多克隆抗體之間存在交叉反應(yīng)，通過Westernblot和ELISA方法得到人源無形體不同分離株AnkA蛋白質(zhì)之間的免疫原性差異不顯著，表明它們之間的空間結(jié)構(gòu)及其相似，抗原表位差異較小；通過與立克次體目成員免疫反應(yīng)存在免疫交叉反應(yīng)表明該重組蛋白無較好的特異性，不適合應(yīng)用于鑒別診斷。
【關(guān)鍵詞】：嗜吞噬細胞無形體 AnkA蛋白 原核表達 免疫原性 交叉反應(yīng)性
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392.1
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-12
• 第一篇 綜述 人粒細胞無形體�。℉umanGranulocyticAnaplasmosis）和嗜吞噬細胞無形體（A.phagocytophilum）12-22
• 1 微生物學(xué)，病理學(xué)和致病機理12-14
• 1.1 分類和命名12-13
• 1.2 微生物學(xué)和致病機理13-14
• 2 生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)14-16
• 2.1 生態(tài)學(xué)14-15
• 2.2 流行病學(xué)15-16
• 3 臨床表現(xiàn)和診斷16-18
• 3.1 臨床表現(xiàn)16-17
• 3.2 診斷17-18
• 4 治療18
• 5 AnkA蛋白18-22
• 第二篇 試驗研究22-56
• 實驗一 嗜吞噬細胞無形體AnkA重組蛋白的克隆表達和鑒定22-46
• 摘要22
• 1 材料和方法22-35
• 1.1 材料22-24
• 1.2 實驗方法24-35
• 2 實驗結(jié)果35-44
• 2.1 蛋白序列分析35-39
• 2.2 ankA目的基因的擴增及純化39
• 2.3 pEASY-T（+）-ankA重組質(zhì)粒鑒定39-40
• 2.4 pEASY-T（+）-ankA質(zhì)粒和表達質(zhì)粒pET30a（+）雙酶切40-41
• 2.5 酶切產(chǎn)物的純化41
• 2.6 ankA目的基因的測序及對比結(jié)果41
• 2.7 小量誘導(dǎo)表達41-42
• 2.8 AnkA重組蛋白的純化42-43
• 2.9 重組蛋白的飛行時間質(zhì)譜分析結(jié)果43
• 2.10 免疫印跡43-44
• 3 討論44-46
• 3.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的意義44-45
• 3.2 融合蛋白與包涵體45-46
• 實驗二 三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白免疫原性差異性研究46-56
• 摘要46
• 1 材料和方法46-51
• 1.1 材料46-47
• 1.2 實驗方法47-51
• 2 實驗結(jié)果51-55
• 2.1 ELISA預(yù)實驗51
• 2.2 小鼠免疫抗體水平的檢測結(jié)果--ELISA以及Westernblot反應(yīng)51-52
• 2.3 重組蛋白與立克次體目常見致病菌交叉反應(yīng)—ELISA以及Westernblot反應(yīng)52-53
• 2.4 AnkA重組蛋白交叉免疫分析—ELISA以及Westernblot反應(yīng)53-55
• 3 討論55-56
• 第三篇 試驗結(jié)論56-58
• 參考文獻58-66
• 致謝66-68
• 附錄68-70
• 作者簡介70-71
• 導(dǎo)師評閱表71

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白原核表達及免疫原性差異性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：377178