發(fā)布時間：2017-05-18 21:16

  本文關鍵詞：三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白原核表達及免疫原性差異性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：嗜吞噬細胞無形體（Anaplasmaphagocytophilum）屬于立克次體目無形體科無形體屬，是一類直徑為0.2-1.0um的經蜱傳播的嚴格細胞內寄生的革蘭氏陰性菌，主要引起人粒細胞無形體病（HumanGranulocyticAnaplasmosis，HGA）。自20世紀90年代初于美國首次發(fā)現以來，澳洲、歐洲多國、韓國及我國先后均有報道，且近年來呈上升趨勢。2006年安徽蕪湖弋磯山醫(yī)院的人粒細胞無形體病院內傳播感染事件是我國第一次報道的人粒細胞無形體病感染確診病例，也是世界范圍內首次報導的人粒細胞無形體人傳人事件。由于該病的臨床多表現為急性不明原因發(fā)熱，肌肉痛，乏力，頭痛等類似病毒感染性疾病癥狀，臨床缺乏對該病的足夠認識，也缺乏相應的快速診斷方法，因此該病及易發(fā)生誤診，嚴重時可導致多器官功能衰竭，甚至死亡。 為探索人源無形體不同分離株AnkA蛋白免疫原性是否存在差異，進一步揭示這些蛋白質間可能存在結構及免疫表位差異以及可能相關的與宿主細胞作用蛋白譜差異。首先利用DNAMAN軟件比對美國Webster株、斯洛文尼亞1567株和美國96HE58株人源無形體分離株AnkA蛋白氨基酸序列，結果發(fā)現三株菌AnkA蛋白的一致性為90.2%，Webster株與96HE58株AnkA蛋白的一致性最高，為95.2%，1567株和96HE58株AnkA蛋白的一致性最低，為90.6%。對這三株無形體AnkA蛋白B淋巴細胞線性表位預測分析發(fā)現Webster株和96HE58株人分離株無形體AnkA蛋白抗原表位存在一個差異，而它們與1567株AnkA蛋白抗原表位預測結果差異較大。 我們對3株無形體不同ankA基因進行了原核表達，同時進行了免疫原性初步分析。利用PCR技術擴增了嗜吞噬細胞無形體Webster株，斯洛文尼亞1567株，美國96HE58株ankA基因部分序列，構建pET-30a-AnkA表達載體，轉化至大腸桿菌BL21中，以IPTG誘導高效表達融合蛋白，經飛行質譜鑒定氨基酸序列，免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體。采用ELISA和Westernblot方法分析三株菌AnkA重組蛋白與免疫小鼠血清抗體相互間，以及與10種常見的立克次體目成員陽性抗體鼠血清間的免疫反應。同時檢測三株菌AnkA重組蛋白與我國無形體病人血清抗體反應性。結果表明表達的重組蛋白主要以可溶性形式存在，小鼠免疫獲得高效價抗AnkAIgG抗體，三株菌重組蛋白免疫抗體之間存在免疫交叉性，與立克次體目成員間存在免疫交叉性。三株菌重組蛋白與我國無形體病人血清抗體存在免疫反應。 本研究成功原核表達并純化了三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白，重組蛋白與我國無形體病人陽性血清存在免疫反應。三株嗜吞噬細胞無形體AnkA重組蛋白與免疫小鼠多克隆抗體之間存在交叉反應，通過Westernblot和ELISA方法得到人源無形體不同分離株AnkA蛋白質之間的免疫原性差異不顯著，表明它們之間的空間結構及其相似，抗原表位差異較�。煌ㄟ^與立克次體目成員免疫反應存在免疫交叉反應表明該重組蛋白無較好的特異性，不適合應用于鑒別診斷。
【關鍵詞】：嗜吞噬細胞無形體 AnkA蛋白 原核表達 免疫原性 交叉反應性
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392.1
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略詞表10-11
• 前言11-12
• 第一篇 綜述 人粒細胞無形體�。℉umanGranulocyticAnaplasmosis）和嗜吞噬細胞無形體（A.phagocytophilum）12-22
• 1 微生物學，病理學和致病機理12-14
• 1.1 分類和命名12-13
• 1.2 微生物學和致病機理13-14
• 2 生態(tài)學和流行病學14-16
• 2.1 生態(tài)學14-15
• 2.2 流行病學15-16
• 3 臨床表現和診斷16-18
• 3.1 臨床表現16-17
• 3.2 診斷17-18
• 4 治療18
• 5 AnkA蛋白18-22
• 第二篇 試驗研究22-56
• 實驗一 嗜吞噬細胞無形體AnkA重組蛋白的克隆表達和鑒定22-46
• 摘要22
• 1 材料和方法22-35
• 1.1 材料22-24
• 1.2 實驗方法24-35
• 2 實驗結果35-44
• 2.1 蛋白序列分析35-39
• 2.2 ankA目的基因的擴增及純化39
• 2.3 pEASY-T（+）-ankA重組質粒鑒定39-40
• 2.4 pEASY-T（+）-ankA質粒和表達質粒pET30a（+）雙酶切40-41
• 2.5 酶切產物的純化41
• 2.6 ankA目的基因的測序及對比結果41
• 2.7 小量誘導表達41-42
• 2.8 AnkA重組蛋白的純化42-43
• 2.9 重組蛋白的飛行時間質譜分析結果43
• 2.10 免疫印跡43-44
• 3 討論44-46
• 3.1 蛋白質二級結構預測的意義44-45
• 3.2 融合蛋白與包涵體45-46
• 實驗二 三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白免疫原性差異性研究46-56
• 摘要46
• 1 材料和方法46-51
• 1.1 材料46-47
• 1.2 實驗方法47-51
• 2 實驗結果51-55
• 2.1 ELISA預實驗51
• 2.2 小鼠免疫抗體水平的檢測結果--ELISA以及Westernblot反應51-52
• 2.3 重組蛋白與立克次體目常見致病菌交叉反應—ELISA以及Westernblot反應52-53
• 2.4 AnkA重組蛋白交叉免疫分析—ELISA以及Westernblot反應53-55
• 3 討論55-56
• 第三篇 試驗結論56-58
• 參考文獻58-66
• 致謝66-68
• 附錄68-70
• 作者簡介70-71
• 導師評閱表71

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：三株嗜吞噬細胞無形體AnkA蛋白原核表達及免疫原性差異性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：377178