本文關(guān)鍵詞：β-arrestin1在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡及胰島素分泌中的作用及機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：縮膽囊素(cholecystokinin, CCK)屬于胃腸激素,是進食引起的小腸黏膜Ⅰ細胞分泌的激素,在調(diào)節(jié)消化和代謝功能方面起著重要作用。已有研究證明,在胰島上,CCK通過作用于縮膽囊素受體(cholecystokinin A receptor, CCKAR)調(diào)節(jié)胰島素的分泌和胰島p細胞的數(shù)量,然而CCK作用于CCKAR后的下游信號通路并沒有明確的報道。胰腺β細胞膜上的CCKAR屬于G蛋白偶聯(lián)受體。本文我們表明,八肽縮膽囊素(CCK-8s)激活CCKAR后誘導(dǎo)了三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate, IP3)和腺苷-3',5’-環(huán)化一磷酸(cAMP)的積累,從而高效地促進了胰島素分泌。CCK-8s除了激活G蛋白信號傳導(dǎo),也促進了CCKAR和β-arrestin1的復(fù)合物的形成。同時,利用siRNA沉默β-arrestin1后進行實驗研究,我們證實,β-arrestin1在CCK-8s促進胰島素分泌和防止胰腺p細胞凋亡的方面都起著重要作用。 β-arrestin1通過介導(dǎo)的胞內(nèi)長時相ERK的激活發(fā)揮抗凋亡作用,慢速時相激活的ERK激活p90RSK-phosphor-Bad抗凋亡途徑并且抑制caspase-3激活。β-arrestin1在CCKAR在胰腺β細胞中的下游的重要性可以為新的抗糖尿病藥物的開發(fā)提供方向。 [研究目的] 研究β-arrestin1在縮膽囊素抗胰島p細胞凋亡及胰島素分泌中的作用及機制。 [研究方法] 1.β-arrestin1在縮膽囊素抗促進胰島素分泌中的作用及機制 (1)用Western blot印跡分析技術(shù)檢查內(nèi)源性CCKAR和β-arrestin1的表達. (2) ELISA檢測胰島素分泌的變化。 (3) ELISA檢測三磷酸肌醇的變化。 (4) ELISA檢測腺苷-3’,5’-環(huán)化一磷酸的變化。 2.p-arrestinl在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡中的作用及機制 (1)使用Hoechst33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測高糖誘導(dǎo)的胰腺β細胞的凋亡。 (2)用Western blot印跡分析技術(shù)檢測p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途徑的激活。 (3) SLIC方法構(gòu)建CCKAR到pcDNA3.1上,并在N端加flag標(biāo)簽。 (4)免疫共沉淀法檢測在HEK293細胞中的β-arrestinl和CCKAR之間的相互作用。 (5)通過siRNA轉(zhuǎn)染MIN6細胞沉默β-arrestinl的表達,研究β-arrestinl缺失后細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、功能的障礙。 [研究結(jié)果] 1. p-arrestinl在縮膽囊素抗促進胰島素分泌中的作用及機制 (1)我們首先證實了小鼠胰島β細胞中表達CCKAR。100pM CCK-8s處理小鼠離體胰島后,胰島素分泌增高4倍。而1μM選擇性CCKAR拮抗劑氯戊米特(Lorglumide)可以阻斷這種效應(yīng)。同樣,100pM CCK-8s處理分離的原代小鼠β胰島細胞也可以導(dǎo)致胰島素分泌增加約5倍,其效應(yīng)也可以被Lorglumide阻斷。 (2)100pM CCK-8s誘導(dǎo)MIN6細胞的IP3的升高占卡巴膽堿誘導(dǎo)IP3的升高程度的40%,100pM CCK-8s誘導(dǎo)MIN6細胞的cAMP的升高程度占10nM的GLP-1誘導(dǎo)的cAMP的升高程度的60%。Gq蛋白的下游抑制劑U73122或者Gs蛋白下游PKA抑制劑H89分別抑制CCK-8s促進的胰島素分泌減少至60%及50%,而同時使用兩種抑制劑,則完全抑制CCK-8s誘導(dǎo)MIN6細胞的胰島素分泌。 2. β-arrestinl在縮膽囊素抗胰島β細胞凋亡中的作用及機制 (1)高糖作用于MIN6細胞72小時后導(dǎo)致85%的細胞凋亡,當(dāng)高糖與GLP-1共同作用于細胞時,細胞凋亡可降低到65%。同樣的,100pM CCK-8s與高糖同時刺激細胞是MIN6細胞的凋亡比例從85%減少到63%。 (2) CCK-8s導(dǎo)致了濃度依賴性的ERK激活,100pM之后ERK的激活強度不再上升。1uM CCKAR拮抗劑Lorglumide預(yù)處理MIN6細胞后阻斷了CCK-8s引起的ERK激活。CCK-8s刺激MIN6細胞促進了兩個時期ERK1/2的激活,一個在刺激2分鐘時迅速達到高峰,另一個是在刺激后20分鐘時達到峰值,激活緩慢而持續(xù)�？焖倭姿峄腅RK1/2在細胞質(zhì)和細胞核中都存在,然而,慢速磷酸化的ERK1/2存在于細胞質(zhì)。 (3) CCK-8s刺激敲低P-arrestinl的MIN6細胞,我們發(fā)現(xiàn),快速時相激活的ERK下降了約30%,而慢速時相激活的ERK下降了90%。 (4) CCK-8s促進CCKAR和β-arrestinl之間的相互作用,在15分鐘達到最強,早于慢速時相ERK激活的時相。 (5) β-arrestinl敲低后顯著抑制CCK-8s誘導(dǎo)的p90RSK(Thr573)和Bad(Ser112)的磷酸化。CCK-8s抑制高糖誘導(dǎo)的caspase-3的切割。 (6) CCK-8s抑制高糖誘導(dǎo)的細胞凋亡,而這種作用在β-arrestinl敲低后被解除。 [結(jié)論] CCK-8s促進胰腺β細胞分泌過程中,Gq信號通路和Gs信號通路均被激活,并且除了G蛋白信號通路參與胰島素分泌外,β-arrestin介導(dǎo)的信號通路也促進胰島素的分泌。 CCK-8s作用于CCKAR后可以促進ERK的磷酸化,從而進一步激活p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途徑,抑制了細胞色素C的釋放,抑制胰腺β細胞的凋亡。此外,β-arrestinl敲低后,ERK激活障礙。以上說明,β-arrestinl在CCK抗胰島p細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：GPCR CCKAR arrestin 胰島素分泌 凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R335
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 符號說明13-14
• 前言14-16
• 材料16-19
• 方法19-28
• 結(jié)果28-44
• 討論44-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-55
• 致謝55-56
• 碩士在讀期間發(fā)表的論文56-57
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表57

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