發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 07:04

  本文關(guān)鍵詞：芳香烴受體AHR通過破壞DNA成環(huán)負(fù)向調(diào)控LPS誘導(dǎo)的骨橋蛋白OPN的表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：芳香烴受體(AHR)是一種被普遍接受的配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子。最近的報(bào)告表明,AhR信號(hào)通路在許多免疫細(xì)胞,如T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)中發(fā)揮重要作用。有各種AhR的配體,例如2,3,7,8-四氯-對-TCDD(TCDD),原初環(huán)境的AhR激動(dòng)劑,調(diào)節(jié)Foxp3+Treg細(xì)胞和產(chǎn)IL-17輔助性T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)的分化,并調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡。未活化的AhR通常伴隨著熱休克蛋白90(HSP90)位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)與配體結(jié)合,AhR的構(gòu)象發(fā)生變化,轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中,并與芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(ARNT)結(jié)合形成異源二聚體,最后與目標(biāo)基因的啟動(dòng)子上的生物外源性應(yīng)答元件(XRE)結(jié)合,從而導(dǎo)致各種調(diào)節(jié)效果。我們之前的研究中指出,通過巨噬細(xì)胞LPS活化后誘導(dǎo)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)和AP-1結(jié)合位點(diǎn)之間的OPN啟動(dòng)子DNA成環(huán),可以上調(diào)骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)。然而對芳香烴受體調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子機(jī)制,尤其是在染色質(zhì)水平的機(jī)制仍知之甚少。 因此我們從以下方面進(jìn)行研究： 研究目的： 1.探討AhR是否調(diào)控LPS介導(dǎo)的OPN表達(dá)。 2.探索AhR調(diào)控LPS介導(dǎo)的OPN表達(dá)的作用機(jī)制。研究方法： 1.驗(yàn)證LPS刺激下巨噬細(xì)胞中AhR表達(dá),建立實(shí)驗(yàn)體系。 1.1腹腔巨噬細(xì)胞分別用LPS處理指定的時(shí)間段。芳香烴受體mRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢查,同時(shí)做RT-PCR和定量PCR,Western blot檢測AhR蛋白質(zhì)的表達(dá)。 1.2小鼠原代腹膜巨噬細(xì)胞,小鼠的脾細(xì)胞,和巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞中AhR的表達(dá),RT-PCR法檢測。 2.AhR負(fù)調(diào)控LPS介導(dǎo)的OPN表達(dá)。 2.1.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞或RAW264.7巨噬細(xì)胞用DMSO或lOnM TCDD進(jìn)行預(yù)處理40分鐘,然后各期用LPS進(jìn)行刺激。OPN表達(dá),Western blot檢測。 2.2.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照siRNA或芳香烴受體siRNA36小時(shí)。芳香烴受體表達(dá),Western blot檢測。 2.3.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照siRNA或芳香烴受體siRNA36小時(shí),預(yù)先用DMSO或10nM的二惡英進(jìn)行預(yù)處理40分鐘,然后用LPS刺激。OPN表達(dá),Western blot檢測。 2.4.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照siRNA或芳香烴受體siRNA36小時(shí).然后用LPS刺激。OPN表達(dá),Western blot檢測。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得類似的結(jié)果。 3.芳香烴受體結(jié)合OPN啟動(dòng)子。 3.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞預(yù)先用DMSO或10nM的TCDD處理40分鐘,然后用LPS刺激,并且用ChIP實(shí)驗(yàn)來評估小鼠中OPN啟動(dòng)子的-2407至-2230區(qū)域內(nèi)的AhR結(jié)合位點(diǎn)與AhR的結(jié)合�？偺崛∥镉米魃蠘訉φ�,并與無關(guān)抗體(抗actin)的免疫沉淀物用作陰性對照。小鼠OPN啟動(dòng)子內(nèi)不結(jié)合芳香烴受體位點(diǎn)的-1926至-1759區(qū)域擴(kuò)增PCR產(chǎn)物用作特異性對照。 4.AhR活化后打破NF-κB和AP-1的DNA成環(huán)。 4.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用DMSO或10nM的TCDD進(jìn)行預(yù)處理40分鐘,然后用LPS刺激,然后使用引物A和引物B對OPN啟動(dòng)子進(jìn)行了3C測定。 4.2小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用DMSO或10nM的TCDD進(jìn)行預(yù)處理40分鐘,然后用LPS刺激,然后進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)來評估P300,p65及c-Jun蛋白對小鼠OPN啟動(dòng)子中-1926到-1759區(qū)域內(nèi)的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)；以及-127至42區(qū) 域內(nèi)的AP-1結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合情況�？偺崛∥镉米魃蠘訉φ�,以及無關(guān)抗體(抗actin)免疫沉淀用作陰性對照。結(jié)論及意義： 在本研究中我們揭示了芳香烴受體激動(dòng)劑TCDD,可芳香烴受體依賴性的抑制LPS誘導(dǎo)的OPN產(chǎn)生。而siRNA敲除AhR的腹腔巨噬細(xì)胞中,LPS誘導(dǎo)OPN表達(dá)大大增加了。此外,我們證明TCDD處理后,AhR結(jié)合至外源性區(qū)域中的骨橋蛋白啟動(dòng)子,并干擾NF-κB與AP-1介導(dǎo)的DNA成環(huán)。因此,我們的研究發(fā)現(xiàn)了新的機(jī)制,芳香烴受體可重塑染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象,調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-12
• 符號(hào)說明12-14
• 前言14-16
• 材料和方法16-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 討論33-37
• 總結(jié)37-38
• 附圖38-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 致謝45-46
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文46-47
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表47

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本文編號(hào)：372732