本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)元特異性NSSR1基因敲除對小鼠腦組織發(fā)育的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：神經(jīng)細(xì)胞特異性絲氨酸/精氨酸富集蛋白(neural salient serine/arginine rich protein-1, NSSR1)是迄今發(fā)現(xiàn)的為數(shù)極少的幾種在神經(jīng)組織高表達(dá)的SR蛋白之一,主要參與調(diào)控前體mRNA剪接,從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已有的研究表明,NSSR1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人和小鼠各組織中廣泛表達(dá),而其蛋白主要在腦組織中表達(dá),具有神經(jīng)組織特異性。在培養(yǎng)的細(xì)胞和低等生物體內(nèi)的研究顯示,NSSR1具有促進神經(jīng)元分化的作用。提示NSSR1蛋白在腦組織的生長發(fā)育中可能具有重要功能,然而迄今為止,關(guān)于NSSR1在高等生物體內(nèi)(in vivo)功能的研究還很少。鑒于此,本論文的總目標(biāo)是,通過構(gòu)建神經(jīng)元特異性敲除NSSR1基因的小鼠,初步研究NSSR1基因敲除對小鼠腦發(fā)育的影響,從而為研究NSSR1蛋白的在體生理功能奠定基礎(chǔ)。 我們首先利用免疫組織化學(xué)的方法觀察野生型(WT)小鼠腦內(nèi)NSSR1蛋白的分布特征,發(fā)現(xiàn)NSSR1蛋白在嗅球[Olfactory Bulb)、皮層(Cerebral Cortex)、海馬(Hippocampus)、上丘(Superior Colliculus)、下丘(Inferior Colliculus)以及小腦(Cerebellum)中大量表達(dá),在其他腦區(qū)較少表達(dá)或幾乎沒有表達(dá)。通過NSSR1抗體和NeuN抗體/GFAP抗體免疫共定位,我們觀察到NSSR1蛋白主要在神經(jīng)元中表達(dá),并且主要在核內(nèi)分布。這些結(jié)果說明,NSSR1的分布具有組織特異性以及細(xì)胞類型特異性的特點。 已有研究顯示,全身性敲除NSSR1基因會導(dǎo)致小鼠的胚胎死亡,提示構(gòu)建條件性敲除NSSR1基因的小鼠對研究其在體功能的必要性。鑒于NSSR1蛋白選擇性地在神經(jīng)元中表達(dá)的特點,我們選擇利用Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建神經(jīng)元特異性敲除NSSR1基因的小鼠。我們主要通過敲除NSSR1基因的exon3而造成該基因的移碼突變,使蛋白翻譯提前終止,產(chǎn)生無功能的截短型NSSR1蛋白。我們首先構(gòu)建了exon3兩端各有一個loxP位點的Flox小鼠,并將其與Nse-Cre小鼠雜交,篩選獲得雙轉(zhuǎn)基因的Cre+Flox+/+小鼠。通過基因和蛋白水平的鑒定,證明這種Cre+Flox+/+小鼠腦組織基因組中exon3被切除,而同時NSSR1蛋白的表達(dá)量也明顯降低。所以Cre+Flox+/+小鼠即為神經(jīng)元特異性敲除NSSR1基因的小鼠(NSSR1cKO小鼠),將這一小鼠作為體內(nèi)研究NSSR1蛋白功能的主要模型。 在成功構(gòu)建了NSSR1基因條件敲除小鼠(cK0小鼠)的基礎(chǔ)上,我們進一步利用該小鼠模型,從小鼠表型、腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)、以及小鼠行為學(xué)指標(biāo)等方面對NSSR1蛋白在小鼠腦發(fā)育中的功能進行研究。 首先我們對不同發(fā)育時期cKO小鼠和正常小鼠的體重、腦的形態(tài)和重量進行了比較,結(jié)果顯示,在出生后1d,7d,14d,21d, lmonth,2month時,兩種小鼠的體重沒有顯著性差異,不同發(fā)育時期兩種小鼠腦的形態(tài)和重量也沒有明顯的差異。即：NSSR1基因的神經(jīng)元特異性敲除沒有引起小鼠個體表征上的顯著改變。 進一步,我們利用結(jié)晶紫(CV)、以及成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物NeuN和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物GFAP染色小鼠腦片的方法,對cKO小鼠腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了分析,結(jié)果顯示,和野生型小鼠相比,cKO小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞CV染色變淺,大腦皮層明顯變厚,皮層的神經(jīng)細(xì)胞個體變小,細(xì)胞間排布更松散。NeuN和GFAP免疫染色的結(jié)果顯示,在cKO小鼠中NeuN的染色變淺,而GFAP染色的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多,且細(xì)胞胞體增大,突起增多。該研究結(jié)果顯示,NSSR1條件敲除引起了腦內(nèi)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的排布、數(shù)量和胞體特征的改變,這可能是通過影響腦內(nèi)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化或成熟來實現(xiàn)的。 為進一步探索NSSR1基因敲除是否影響小鼠腦內(nèi)細(xì)胞增殖、凋亡、分化或成熟,我們針對不同發(fā)育階段的神經(jīng)元標(biāo)記物DCX和MAP2對小鼠腦片進行免疫組織(熒光)化學(xué)分析,結(jié)果顯示,和同窩對照小鼠相比,cKO小鼠視皮層DCX標(biāo)記的幼稚神經(jīng)元數(shù)目增多,整個皮層MAP-2標(biāo)記的神經(jīng)元樹突密度減少、長度變短。而在海馬區(qū),DCX標(biāo)記的熒光信號減弱,且細(xì)胞突起的長度變短,而MAP2標(biāo)記的成熟神經(jīng)元的突起反而增加。 鑒于海馬是小鼠學(xué)習(xí)記憶的主要腦區(qū),我們進一步用水迷宮和新物體識別實驗研究了NSSR1基因敲除對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響,結(jié)果顯示,和同窩對照小鼠相比,NSSR1cKO小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和對新物體的識別能力都有顯著降低。 綜上所述,本論文在成功構(gòu)建NSSR1基因神經(jīng)元特異性敲除小鼠的基礎(chǔ)上,從小鼠腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)和小鼠行為學(xué)等方面對NSSR1在小鼠腦發(fā)育中的功能進行了初步探索,結(jié)果顯示,NSSR1基因條件敲除對小鼠腦皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量和排布、神經(jīng)元的分化和成熟、以及小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能均有顯著的影響。提示NSSR1可能通過影響腦內(nèi)細(xì)胞凋亡、增殖、神經(jīng)元分化和成熟而影響腦的發(fā)育,從而影響腦的學(xué)習(xí)記憶功能。NSSR1對上述功能的影響是否通過影響相關(guān)功能基因的表達(dá)和剪接來實現(xiàn),有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：NSSR1 條件性基因敲除 腦發(fā)育 前體mRNA 剪接調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R338
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第1部分 NSSR1蛋白在小鼠腦中的表達(dá)分布12-19
• 摘要12
• 材料與方法12-15
• 結(jié)果15-18
• 討論18-19
• 第2部分 神經(jīng)元特異性NSSR1基因敲除小鼠的構(gòu)建與鑒定19-29
• 摘要19
• 材料和方法19-23
• 結(jié)果23-27
• 討論27-29
• 第3部分 神經(jīng)元NSSR1基因敲除對小鼠腦發(fā)育的影響29-44
• 摘要29
• 材料和方法29-31
• 結(jié)果31-42
• 討論42-44
• 論文小結(jié)44-46
• 致謝46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 綜述49-55
• 參考文獻(xiàn)54-55

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本文編號：372575