發(fā)布時(shí)間：2017-05-17 07:17

  本文關(guān)鍵詞：CHIKV、SINV和JEV可視化基因芯片的建立及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus, CHIKV)和辛德畢斯病毒(Sindbis Virus, SINV)是甲病毒屬單鏈RNA病毒，經(jīng)蚊蟲傳播，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，有致病快，傳播迅速等特點(diǎn)，其流行對(duì)世界公共安全造成威脅。目前缺乏對(duì)兩種病毒引起疾病的有效治療藥物，因此，對(duì)兩種病毒快速有效地進(jìn)行診斷是預(yù)防控制和減緩病毒傳播的重要措施。 乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是RNA病毒，能引發(fā)病毒性的腦炎，經(jīng)庫(kù)蚊等在動(dòng)物與人之間傳播。在亞洲的東部和南部及太平洋等地區(qū)廣泛流行。目前已應(yīng)用乙型腦炎疫苗防治，但尚缺乏特異性抗病毒藥物，因此，對(duì)乙型腦炎的早期診斷顯得極為重要。 基因芯片技術(shù)(Gene Chip Technology)有較高的特異性和靈敏度及高通量等特點(diǎn)，在對(duì)環(huán)境和臨床檢測(cè)上有良好的應(yīng)用。目前有多種基因芯片技術(shù)，，以熒光、同位素、酶標(biāo)標(biāo)記在核酸檢測(cè)中比較普遍。但有靈敏度較低，操作復(fù)雜，對(duì)條件和設(shè)備有著較高的要求等問(wèn)題，限制了這類技術(shù)在檢測(cè)病例中的應(yīng)用。納米金標(biāo)記比熒光標(biāo)記檢測(cè)在敏感性上高100倍，簡(jiǎn)便快速，不需特殊的儀器，結(jié)果肉眼可看見(jiàn)。本文將納米金標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用在可視化基因芯片制備中，旨在建立對(duì)CHIKV、SINV和JEV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、價(jià)廉、操作簡(jiǎn)單的診斷研究的可視化基因芯片方法，分別探討了CHIKV和SINV熒光檢測(cè)基因芯片和可視化檢測(cè)基因芯片的制備及兩者的比較與JEV可視化分型基因芯片的制備。主要內(nèi)容包括: 一、CHIKV和SINV可視化檢測(cè)基因芯片和熒光檢測(cè)基因芯片的研制及兩者之間的比較 本實(shí)驗(yàn)室已初步建立了CHIKV和SINV熒光檢測(cè)基因芯片，在此基礎(chǔ)上，建立了兩種病毒可視化檢測(cè)基因芯片和熒光檢測(cè)基因芯片。我們以已有CHIKV和SINV E基因序列為模板，重新設(shè)計(jì)檢測(cè)探針和引物并對(duì)探針進(jìn)行氨基修飾，對(duì)引物進(jìn)行熒光素/生物素修飾。使用芯片點(diǎn)樣儀對(duì)探針進(jìn)行點(diǎn)樣，在37℃的濕潤(rùn)環(huán)境下將檢測(cè)探針固定到醛基玻片上，同時(shí)，以分別含CHIKV和SINV E基因的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增待檢測(cè)片段，變性后雜交到探針芯片，洗脫后熒光標(biāo)記基因芯片通過(guò)特殊掃描儀掃描分析結(jié)果，而可視化基因芯片利用生物素與鏈霉親和素高度親和的特性在檢測(cè)芯片上標(biāo)記納米金，銀增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)可視化。以酶切鑒定正確的CHIKV和SINV E基因序列為模板反向轉(zhuǎn)錄為RNA模擬真實(shí)的CHIKV和SINV RNA，將CHIKV和SINV RNA分別與提取的PRRSV，JEV-III，AIV RNA混合逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR電泳鑒定各病毒cDNA的存在，使用CHIKV和SINV特異引物對(duì)各種病毒PCR擴(kuò)增靶序列并與探針芯片雜交進(jìn)行可視化基因芯片特異性實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也進(jìn)行靈敏度、重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，可視化基因芯片比熒光檢測(cè)芯片方法對(duì)CHIKV和SINV的靈敏度檢測(cè)結(jié)果分別為2.4×10-6ng/mL，2.0×10-8ng/mL和2.4×10-4ng/mL，2.0×10-5ng/mL，兩者與PCR方法比較差異顯著，可視化基因芯片比熒光檢測(cè)芯片靈敏度可高出100倍，并且可視化基因芯片檢測(cè)方法對(duì)兩種病毒都具有良好的特異性和重復(fù)性。 二、JEV可視化分型基因芯片的研制 本實(shí)驗(yàn)室已初步建立了JEV熒光分型基因芯片，以此為基礎(chǔ)建立了JEV可視化分型基因芯片。將已設(shè)計(jì)的氨基修飾檢測(cè)探針點(diǎn)樣并固定到醛基玻片上，同時(shí)，對(duì)已有引物序列5’末端進(jìn)行生物素修飾，以已有的分別含乙型腦炎病毒I型（JEV-I）和乙型腦炎病毒III型（JEV-III）的PrM和E基因序列的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增待檢測(cè)目的片段，變性后雜交到檢測(cè)探針芯片，利用生物素與鏈霉親和素高度親和的特性在檢測(cè)芯片上標(biāo)記納米金，銀增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)可視化。進(jìn)行靈敏度、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，JEV分型可視化基因芯片檢測(cè)到JEV-I和JEV-III的靈敏度分別為8.1×105拷貝數(shù)/mL和7.9×105拷貝數(shù)/mL，且具有良好的特異性和重復(fù)性。
【關(guān)鍵詞】：基孔肯雅病毒 辛德畢斯病毒 乙型腦炎病毒 基因芯片 可視化
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 目錄4-7
• 英文縮略詞7-8
• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-15
• 第一章 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析和已有質(zhì)粒克隆及鑒定15-25
• 1.1 材料16-17
• 1.1.1 應(yīng)用軟件16
• 1.1.2 菌株和質(zhì)粒16
• 1.1.3 主要儀器16
• 1.1.4 主要試劑和工具酶16
• 1.1.5 溶液配制16-17
• 1.2 方法17-19
• 1.2.1 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析17
• 1.2.2 CHIKV 和 SINV 質(zhì)粒的酶切鑒定17
• 1.2.3 CHIKV 和 SINV 酶切產(chǎn)物的回收純化及測(cè)序17-18
• 1.2.4 CHIKV 和 SINV 質(zhì)粒的克隆18
• 1.2.5 CHIKV 和 SINV 探針及引物設(shè)計(jì)18-19
• 1.3 結(jié)果19-23
• 1.3.1 CHIKV 和 SINV E 基因序列分析結(jié)果19-21
• 1.3.2 分別含 CHIKV 和 SINV E 基因質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果21-22
• 1.3.3 克隆分別含 CHIKV 和 SINV E 基因質(zhì)粒的濃度測(cè)定22
• 1.3.4 CHIKV 和 SINV E 基因片段的測(cè)序結(jié)果22
• 1.3.5 CHIKV 和 SINV 引物探針設(shè)計(jì)結(jié)果22-23
• 1.4 討論23-25
• 第二章 CHIKV 和 SINV 熒光基因芯片和可視化基因芯片的制備25-35
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 質(zhì)粒和病毒25
• 2.1.2 主要試劑和工具酶25
• 2.1.3 主要儀器25-26
• 2.1.4 主要溶液及配制26
• 2.2 方法26-29
• 2.2.1 探針點(diǎn)樣、固定、洗脫26
• 2.2.2 CHIKV 和 SINV 質(zhì)粒擴(kuò)增26-27
• 2.2.3 CHIKV 和 SINV 質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物雜交探針芯片27-28
• 2.2.4 熒光檢測(cè)基因芯片掃描28
• 2.2.5 可視化檢測(cè)基因芯片標(biāo)記納米金28
• 2.2.6 銀增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)可視化28
• 2.2.7 兩種檢測(cè)芯片靈敏度檢測(cè)28
• 2.2.8 兩種檢測(cè)芯片特異性檢測(cè)28-29
• 2.2.9 兩種檢測(cè)芯片重復(fù)性檢測(cè)29
• 2.3 結(jié)果29-33
• 2.3.1 檢測(cè)探針點(diǎn)樣矩陣29
• 2.3.2 CHIKV 和 SINV 質(zhì)粒目的片段擴(kuò)增電泳鑒定結(jié)果29-30
• 2.3.3 熒光檢測(cè)基因芯片結(jié)果30
• 2.3.4 可視化檢測(cè)芯片結(jié)果30
• 2.3.5 兩種檢測(cè)芯片靈敏度檢測(cè)結(jié)果30-31
• 2.3.6 兩種檢測(cè)芯片特異性檢測(cè)結(jié)果31-32
• 2.3.7 可視化檢測(cè)芯片重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果32-33
• 2.4 討論33-35
• 2.4.1 芯片探針點(diǎn)樣及固定優(yōu)化33
• 2.4.2 芯片雜交反應(yīng)條件優(yōu)化33-34
• 2.4.3 納米金標(biāo)記及銀增強(qiáng)優(yōu)化34
• 2.4.4 芯片檢測(cè)結(jié)果的判定34-35
• 第三章 JEV 已有質(zhì)粒陽(yáng)性克隆及鑒定35-43
• 3.1 材料35-36
• 3.1.1 菌株和質(zhì)粒35
• 3.1.2 主要試劑35-36
• 3.1.3 主要儀器36
• 3.1.4 溶液和培養(yǎng)基配制36
• 3.2 方法36-38
• 3.2.1 JEV-III 質(zhì)粒酶切鑒定36-37
• 3.2.2 JEV-III 酶切產(chǎn)物回收純化及測(cè)序37
• 3.2.3 JEV-I 和 JEV-III 已有質(zhì)�？寺�37
• 3.2.4 JEV 鑒別用檢測(cè)探針、陽(yáng)性坐標(biāo)探針和擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)37-38
• 3.3 結(jié)果38-41
• 3.3.1 克隆質(zhì)粒濃度測(cè)定38
• 3.3.2 JEV-III 質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果38
• 3.3.3 JEV-III 測(cè)序結(jié)果和 JEV-I 合成序列38-40
• 3.3.4 檢測(cè)探針、陽(yáng)性坐標(biāo)探針及擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)結(jié)果40-41
• 3.4 討論41-43
• 第四章 JEV 可視化分型檢測(cè)基因芯片制備及初步應(yīng)用43-53
• 4.1 材料43-44
• 4.1.1 病毒和質(zhì)粒43
• 4.1.2 主要試劑43-44
• 4.1.3 主要儀器44
• 4.1.4 溶液配制44
• 4.2 方法44-48
• 4.2.1 檢測(cè)探針點(diǎn)樣、固定、洗脫44-45
• 4.2.2 JEV 待檢測(cè)目的片段擴(kuò)增45
• 4.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物雜交探針芯片45-46
• 4.2.4 基因芯片標(biāo)記納米金46
• 4.2.5 銀增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)可視化46
• 4.2.6 靈敏度檢測(cè)46
• 4.2.7 特異性檢測(cè)46-47
• 4.2.8 重復(fù)性檢測(cè)47
• 4.2.9 JEV 分型可視化基因芯片初步應(yīng)用47-48
• 4.3 結(jié)果48-51
• 4.3.1 JEV 質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果48
• 4.3.2 可視化檢測(cè)基因芯片對(duì)乙型腦炎分型檢測(cè)結(jié)果48-49
• 4.3.3 靈敏度檢測(cè)結(jié)果49-50
• 4.3.4 特異性檢測(cè)結(jié)果50
• 4.3.5 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果50
• 4.3.6 初步應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果50-51
• 4.4 討論51-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 致謝58-59
• 文獻(xiàn)綜述59-80
• 一、CHIKV和SINV危害性及流行情況59-63
• 二、CHIKV和SINV檢測(cè)方法進(jìn)展63-65
• 三、JEV危害性及流行情況65-67
• 四、JEV的檢測(cè)方法研究進(jìn)展67-68
• 五、基因芯片技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用68-71
• 參考文獻(xiàn)71-79
• 摘要79-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷80
• 參與課題80
• 碩士生期間投稿文章80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：CHIKV、SINV和JEV可視化基因芯片的建立及初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：372798