本文關(guān)鍵詞：免疫調(diào)節(jié)分子PDCD4和TIPE2在炎癥及腫瘤中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的 肺癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)兩大病理類型,其中非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%以上,包括鱗癌,腺癌,腺鱗癌等多種組織學(xué)類型。肺癌是一種異質(zhì)性疾病,近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多種基因的表達(dá)調(diào)控異常,參與腫瘤細(xì)胞周期、生長(zhǎng)分化、細(xì)胞移動(dòng)和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。研究與肺癌相關(guān)的新基因?qū)沂酒浒l(fā)病機(jī)制和進(jìn)行干預(yù)治療有重要價(jià)值。 TIPE2,即腫瘤壞死因子a誘導(dǎo)蛋白8-2(Tumor necrosis factor-α induced protein-8-like2, TNFAIP8L2),是一種新型的免疫負(fù)調(diào)控基因。在小鼠中TIPE2選擇性表達(dá)于免疫器官和淋巴組織。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人TIPE2除表達(dá)于免疫細(xì)胞外,還表達(dá)于多種非免疫組織器官,如,肝細(xì)胞,復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞及某些腺上皮細(xì)胞等。TIPE2蛋白在大量非免疫細(xì)胞中的表達(dá)提示其除了具有免疫調(diào)節(jié)作用外還可能具有其他功能。近期研究發(fā)現(xiàn),TIPE2能夠特異性與RGL結(jié)合,阻斷RAS信號(hào)通路的活化,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng),遷移發(fā)揮重要的抑制作用,同時(shí)發(fā)現(xiàn)人TIPE2在肝癌中的表達(dá)顯著低于在癌旁組織,從而推測(cè)TIPE2可能具有抑癌功能。隨后又有發(fā)現(xiàn)TIPE2能夠抑(?)PI3K-Rac信號(hào)通路的活化,從而調(diào)控由RNA引起固有免疫應(yīng)答過(guò)程。同年該研究組又提出,TIPE2能夠通過(guò)其N端的賴氨酸或精氨酸殘基(Lys-15, Lys-16和Arg-24)特異性的與Rac1蛋白C端的CAAX模體結(jié)合,從而抑制Racl蛋白及其下游信號(hào)通路的活化。Rac屬于Rho家族小GTP酶,是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白重組和板狀偽足形成的主要效應(yīng)分子,在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,那么TIPE2是否會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)Racl信號(hào)通路從而影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,發(fā)揮抑癌基因的功能呢?目前還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道。 TIPE2基因在各種類型的癌癥特別是肺癌中的作用情況如何,還尚沒(méi)有研究報(bào)道。為了探討TIPE2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)狀態(tài)及其功能機(jī)制,本論文從臨床病例到體外細(xì)胞模型,系統(tǒng)的研究了TIPE2在肺癌中的表達(dá)及功能。 研究方法 1. Realtime PCR的方法檢測(cè)TIPE2在肺癌及癌旁組織中的表達(dá) 從齊魯醫(yī)院收集肺癌手術(shù)中切除的肺癌組織及癌旁組織標(biāo)本(n=7),抽提RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,通過(guò)Realtime PCR的方法從RNA水平上檢測(cè)TIPE2的表達(dá)變化。 2. Western-blot的方法檢測(cè)TIPE2在肺癌及癌旁組織中的表達(dá) 將肺癌及癌旁組織分別抽提蛋白進(jìn)行Western-blot,檢測(cè)肺癌及癌旁中TIPE2蛋白的表達(dá)情況。 3.免疫組織化學(xué)檢測(cè)TIPE2在肺癌及癌旁中的表達(dá) 利用人類非小細(xì)胞肺癌組織芯片,通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)各種組織學(xué)類型的肺癌及癌旁組織中TIPE2在蛋白水平的表達(dá)情況。 4.CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將A549或H1975兩種肺癌細(xì)胞系接種于96孔板中,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),分別轉(zhuǎn)染空載體(PRK5-MOCK)和含人全長(zhǎng)TIPE2的重組載體(PRK5-TIPE2),于轉(zhuǎn)染Oh、24h和48h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A)。 5.克隆形成實(shí)驗(yàn) 將A549或H1975兩種肺癌細(xì)胞系接種于24孔板中,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,在轉(zhuǎn)染24h時(shí),將細(xì)胞用胰酶消化,以適當(dāng)密度接種于六孔板中,靜置培養(yǎng)10天,1%由甲醇稀釋的結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù),計(jì)算克隆形成數(shù)。 6.遷移及侵襲力實(shí)驗(yàn) 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549或H1975細(xì)胞24小時(shí)后,分別接種于未鋪或鋪(?)natrigel的Transwell小室中,培養(yǎng)12-20h用于遷移檢測(cè),或培養(yǎng)24-48h用于侵襲檢測(cè),用濕棉棒輕輕擦去上室中細(xì)胞,固定,小室膜風(fēng)干,結(jié)晶紫染色,用流水沖干凈,顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)高倍鏡視野,計(jì)算整個(gè)小室膜上穿膜細(xì)胞數(shù)。 7.基因測(cè)序：調(diào)取肺癌細(xì)胞系中的TIPE2基因并進(jìn)行測(cè)序,與TIPE2質(zhì)粒和基因庫(kù)中TIPE2基因序列進(jìn)行比對(duì),檢測(cè)肺癌中內(nèi)源性的TPE2是否發(fā)生基因改變。 8.小干擾體系的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成TIPE2基因的小干擾RNA,將A549或H1975兩種肺癌細(xì)胞系接種于24孔板中,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)染Negative control和SiRNA-TPE2,在轉(zhuǎn)染24h時(shí),將細(xì)胞用胰酶消化,分別接種于未鋪或鋪matrigel的24孔板中進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。 9.統(tǒng)計(jì)分析 不同組織學(xué)類型的肺癌病例,其腫瘤組織與相應(yīng)的癌旁組織TIPE2蛋白的差異表達(dá)：采用非配對(duì)t檢驗(yàn)；TIPE2在肺癌中的表達(dá)與臨床參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析：采用Spearman相關(guān)分析。 結(jié)果 一、TIPE2在肺癌和癌旁組織中的表達(dá)及臨床意義1. Realtime PCR結(jié)果顯示,肺癌組織與癌旁組織中TIPE2的RNA表達(dá)水平并無(wú)顯著差異。 2. Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺癌組織中的TIPE2表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。 3.對(duì)75例肺癌組織芯片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TIPE2在肺癌中的表達(dá)要明顯強(qiáng)于其相應(yīng)癌旁組織。TIPE2主要表達(dá)在肺癌鱗狀或腺狀上皮組織的細(xì)胞漿內(nèi),少數(shù)表達(dá)在核內(nèi)。 4.盡管統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示TIPE2在肺癌中的表達(dá)與患者的性別,年齡,組織類型,及腫瘤大小等均無(wú)明顯的相關(guān)性,但仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn),在某些低分化(病理分級(jí)為Ⅲ級(jí))的肺癌組織局部,鱗狀或腺狀上皮組織結(jié)構(gòu)消失,細(xì)胞形態(tài)混亂并有單細(xì)胞遷出現(xiàn)象,此時(shí)TIPE2表達(dá)降低甚至缺失,提示TIPE2可能與肺癌的晚期侵襲和遷移過(guò)程相關(guān)。 二、外源性TIPE2過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞惡性行為的影響 1. TIPE2過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響：為了研究TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,我們選取A549或H1975細(xì)胞,轉(zhuǎn)染MOCK和TIPE2質(zhì)粒,通過(guò)CCK8法檢測(cè)在Oh、24h和48h的吸光度,結(jié)果顯示兩組細(xì)胞其CCK8值在各時(shí)間段均無(wú)顯著差異,說(shuō)明TIPE2基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。 2. TIPE2過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成能力：克隆形成實(shí)驗(yàn)檢鋇TIPE2對(duì)肺癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。研究發(fā)(?)TIPE2具有抑制肺癌細(xì)胞克隆形成的能力。 3. TIPE2過(guò)表達(dá)明顯抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力：我們利用Transwell系統(tǒng)和Transwell小室上鋪matrigel基質(zhì)膠在體外進(jìn)一步檢測(cè)了TIPE2對(duì)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TIPE2的腫瘤細(xì)胞其遷移和侵襲能力明顯降低。該結(jié)果說(shuō)明TIPE2基因能夠抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。 三、TIPE2沉默表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞功能的影響 1.內(nèi)源性基因沒(méi)有發(fā)生變異：基因測(cè)序結(jié)果顯示肺癌細(xì)胞內(nèi)源性的TIPE2基因序列沒(méi)有發(fā)生基因改變。 2. TIPE2沉默表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲：為了進(jìn)一步確定肺癌中內(nèi)源性TIPE2的功能,我們將肺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染TIPE2基因小干擾序列(Si-TIPE2),沉默內(nèi)源性的TIPE2表達(dá),之后檢測(cè)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力是否發(fā)生改變。結(jié)果顯示,沉默內(nèi)源性的TIPE2表達(dá)后,腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。該結(jié)果說(shuō)明肺癌中內(nèi)源性的TIPE2同樣發(fā)揮抑癌基因的功能。 四、TIPE2通過(guò)影響Racl信號(hào)通路從而發(fā)揮其抑癌功能 1.轉(zhuǎn)染Racl結(jié)合區(qū)突變的TIPE2載體(MUTANT)組與轉(zhuǎn)染TIPE2質(zhì)粒組相比,肺癌細(xì)胞的克隆形成能力顯著增強(qiáng),并恢復(fù)到轉(zhuǎn)染MOCK組水平。 2.轉(zhuǎn)染MUTANT載體組與轉(zhuǎn)染TIPE2質(zhì)粒組相比,肺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng),并恢復(fù)到轉(zhuǎn)染MOCK組水平。 3.轉(zhuǎn)染MUTANT載體組與轉(zhuǎn)染TIPE2質(zhì)粒組相比,肺癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng),并恢復(fù)到轉(zhuǎn)染MOCK組水平。 結(jié)論 1.TIPE2蛋白在肺癌中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁組織,而在RNA水平上表達(dá)無(wú)差異,提示TIPE2在肺癌中的表達(dá)調(diào)控是從翻譯水平上進(jìn)行的。 2. TIPE2基因能明顯抑制肺癌細(xì)胞的克隆形成和遷移、侵襲能力,表現(xiàn)出抑癌基因的功能。 3. TIPE2在肺癌中發(fā)揮其抑癌功能,是通過(guò)調(diào)節(jié)Rac1信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 創(chuàng)新性及意義 1.本研究首次提出盡管TIPE2在肺癌中高表達(dá),但體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TIPE2能夠通過(guò)抑制Rac信號(hào)通路從而影響肺癌的克隆形成,遷移和侵襲,表現(xiàn)出抑癌基因的功能。 2.首次證實(shí)TIPE2不僅具有免疫負(fù)調(diào)控作用,而且具有抑癌基因的功能,研究結(jié)果對(duì)TIPE2功能的揭示和肺癌發(fā)病機(jī)制的研究具有重要的理論價(jià)值和潛在的應(yīng)用價(jià)值。 局限性 1.本研究由于芯片病理量有限,臨床分級(jí)主要集中在Ⅱ級(jí),只有少量Ⅲ級(jí)患者,因此不能對(duì)TIPE2表達(dá)與臨床分級(jí)進(jìn)行準(zhǔn)確的相關(guān)性分析。 2.由于研究時(shí)間限制,TIPE2通過(guò)Rac1影響肺癌細(xì)胞惡性行為的具體信號(hào)通路還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究證實(shí)。 研究目的 程序性細(xì)胞死亡-4(Programmed cell death4, PDCD4)是1995年科學(xué)家在研究細(xì)胞凋亡時(shí)從小鼠細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的凋亡相關(guān)基因�，F(xiàn)已證實(shí)它是一種蛋白翻譯抑制分子,能夠通過(guò)其MA-3功能域與真核細(xì)胞翻譯起始因子eIF4A結(jié)合,從而抑制多種蛋白的合成。我們和其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn),PDCD4能夠在人多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的抑制作用,從而該基因被定義為一種新的抑癌基因。而近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)PDCD4不僅具有抑癌作用,還與炎癥的發(fā)生相關(guān),那么PDCD4基因?qū)γ庖呒?xì)胞的影響如何呢?目前還沒(méi)有明確的研究報(bào)道。 T細(xì)胞是機(jī)體發(fā)揮適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞,而樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是最重要的抗原遞呈細(xì)胞,這兩種免疫細(xì)胞在機(jī)體的免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)中相互配合,共同發(fā)揮其免疫學(xué)功能,維護(hù)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)。本研究的目的是通過(guò)研究PDCD4基因?qū)細(xì)胞和DC分化的影響,從而為PDCD4在炎癥性疾病中的作用機(jī)制提供理論依據(jù),本課題從以下兩個(gè)方面進(jìn)行了研究： 一、PDCD4基因?qū)淋巴細(xì)胞亞群分化的影響：利用PDCD4基因敲除小鼠與野生型小鼠對(duì)比,檢測(cè)PDCD4基因缺失后脾臟和淋巴結(jié)中的各T細(xì)胞亞群的分化比例是否發(fā)生變化。 二、PDCD4對(duì)骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞分化的影響：首先通過(guò)骨髓誘導(dǎo)的方式體外誘導(dǎo)獲得DC,然后比較Pdcd4-/-和C57BL/6兩種小鼠來(lái)源的DC的表型特征以及細(xì)胞因子和NO分泌是否有所差異。 研究方法 一、PDCD4基因?qū)淋巴細(xì)胞亞群分化的影響 1.分離Pdcd4-/-和C57BL/6兩組小鼠的脾臟和淋巴結(jié),分別制備單細(xì)胞懸液。 2.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組小鼠來(lái)源的脾臟和淋巴結(jié)中CD8+T、CD4+T以及CD4+T細(xì)胞亞群Th1、Th2、Th17和CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例差異。 二、PDCD4對(duì)骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞分化的影響 1.無(wú)菌分離Pdcd4-/-和C57BL/6兩組小鼠的骨髓細(xì)胞,在細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF的作用下誘導(dǎo)DC的分化,誘導(dǎo)六天獲得未成熟DC,于第七天加入LPS刺激24小時(shí)即獲得成熟DC。 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PDCD4基因缺失后是否對(duì)DC的分化及表型產(chǎn)生影響。 3.分離成熟DC的細(xì)胞培養(yǎng)上清,利用ELISA以及細(xì)胞因子流式微球試劑盒檢測(cè)兩組DC培養(yǎng)上清中炎性因子TGF-β以及IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ, TNF-α和IL-12的濃度差異； 4.利用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PDCD4基因缺失后是否影響DC中NO的分泌； 5.收集兩組DC,抽提RNA和蛋白,利用RT-PCR和Western-blot的方法從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)PDCD4基因缺失的DC其一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)是否發(fā)生變化； 結(jié)果 一、PDCD4基因?qū)淋巴細(xì)胞亞群分化的影響 1. PDCD4基因?qū)D4+T、CD8+T細(xì)胞分化的影響 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD8+T和CD4+T細(xì)胞標(biāo)志性分子CD8和CD4表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PDCD4基因缺失小鼠脾臟及淋巴結(jié)中CD8+T細(xì)胞比例較C57BL/6小鼠有顯著降低,而CD4+T的比例并無(wú)顯著差異。 2. PDCD4基因?qū)D4+T細(xì)胞亞群Thl、Th2和Th17的影響 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD4+T細(xì)胞亞群Thl、Th2和Th17表面標(biāo)志性分子IFN-γ、IL-4和IL-17的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PDCD4基因缺失小鼠中Th1、Th2和Th17的細(xì)胞比例均無(wú)顯著變化。 3. PDCD4基因?qū)D4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)分化的影響 PDCD4基因缺失小鼠較C57BL/6小鼠其脾臟和淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例明顯升高。 二、PDCD4對(duì)骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞分化發(fā)育的影響 1. PDCD4基因的缺失對(duì)骨髓來(lái)源的DC誘導(dǎo)的影響 兩組小鼠來(lái)源的骨髓細(xì)胞在誘導(dǎo)六天之后,獲得未成熟的DCs,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DC特異性表面分子CDllc, CD80, CD86以及MHCII進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩組DC中其CD11c陽(yáng)性率均達(dá)到百分之七十以上且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明DC誘導(dǎo)成功,且兩組DC中其CD11c, CD80, CD86以及MHCII的表達(dá)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示PDCD4基因并不能影響未成熟DC的誘導(dǎo)。 2. PDCD4基因?qū)C成熟表型的影響 為了檢測(cè)PDCD4基因是否對(duì)DC的成熟有一定的影響,我們利用LPS刺激,使DC分化成熟,并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組成熟DC其表面分子CD80, CD86以及MHCII表達(dá)是否出現(xiàn)差異。結(jié)果顯示PDCD4基因缺失后并不能影響DC表面協(xié)同刺激分子CD80和MHCII的表達(dá),而對(duì)CD86的表達(dá)具有明顯的抑制作用。提示PDCD4能夠影響CD86的表達(dá),從而參與DC的表型成熟。 3. PDCD4基因?qū)C細(xì)胞因子分泌的影響 為了檢測(cè)PDCD4基因缺失之后DC的細(xì)胞因子表達(dá)是否受到影響,我們收集成熟DC的細(xì)胞培養(yǎng)上清,通過(guò)ELISA檢測(cè)兩組上清中TGF-β的表達(dá),結(jié)果也并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們又利用流式細(xì)胞微球芯片試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子(IL-6, IL-10, MCP-1, IFN-γ、TNF-α和IL-12)的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組上清中這六種細(xì)胞因子的表達(dá)均無(wú)顯著差異。上述結(jié)果說(shuō)明PDCD4基因?qū)C細(xì)胞因子的分泌并無(wú)明顯影響。 4. PDCD4基因?qū)C分泌NO的影響我們利用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了兩種DC培養(yǎng)上清中NO的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDCD4基因缺失的DC培養(yǎng)上清中NO的表達(dá)量顯著高于C57BL/6組,說(shuō)明PDCD4基因缺失的DC能夠表達(dá)高水平的NO。 5. PDCD4基因?qū)O合成酶iNOS表達(dá)的影響 一氧化氮合酶(iNOS)是NO產(chǎn)生的重要的酶類,我們通過(guò)RT-PCR從RNA水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PDCD4基因缺失的DC與野生型DC相比其iNOS的表達(dá)并無(wú)明顯變化；而通過(guò)Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PDCD4基因缺失的DC其iNOS表達(dá)水平明顯高于野生對(duì)照組。這些結(jié)果提示PDCD4能夠影響iNOS的表達(dá),且其對(duì)iNOS表達(dá)的調(diào)控是從翻譯水平上進(jìn)行的。 結(jié)論 1. PDCD4缺失能夠降低外周免疫器官CD8+T細(xì)胞的比例但對(duì)CD4+T細(xì)胞的影響不大；在CD4+細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的比例升高,但并不影響Th1、Th2和Th17的比例。這些結(jié)果說(shuō)明PDCD4能夠影響部分T細(xì)胞亞群的分化。 2.盡管.PDCD4基因?qū)撬鑱?lái)源的DC的誘導(dǎo)無(wú)明顯影響；但它能夠影響成熟DC的表型,缺失PDCD4的成熟DC表達(dá)低水平CD86,且產(chǎn)生高水平的iNOS和NO,提示PDCD4有可能對(duì)DC的功能產(chǎn)生一定的影響。 創(chuàng)新性和研究意義 首次探索了PDCD4基因?qū)γ庖呒?xì)胞—T細(xì)胞和DC分化的影響,豐富了對(duì)PDCD4基因功能的研究,也為研究PDCD4基因?qū)γ庖咝约膊〉淖饔锰峁┝藢?shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 局限性 1.由于技術(shù)的限制,本論文僅是用敲基因小鼠作為研究對(duì)象,沒(méi)有在PDCD4過(guò)表達(dá)體系中驗(yàn)證結(jié)果。 2.由于研究時(shí)間有限,本課題側(cè)重于PDCD4影響T細(xì)胞和DC分化這一現(xiàn)象的研究,而對(duì)具體的影響機(jī)制以及對(duì)其功能的影響還有待于進(jìn)一步探討。
【關(guān)鍵詞】：TIPE2 肺癌 抑癌基因 Rac1 PDCD4 T細(xì)胞亞群 樹(shù)突狀細(xì)胞 NO iNOS
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;R734.2
【目錄】：

• 中文摘要8-17
• ABSTRACT17-25
• 符號(hào)說(shuō)明25-27
• 論文一：TIPE2基因在肺癌中的表達(dá)狀態(tài)、臨床意義及功能研究27-65
• 前言27-31
• 一、肺癌的概述27-28
• 二、癌細(xì)胞的遷移和侵襲機(jī)制28
• 三、TIPE2基因概述28-30
• 四、研究目的30-31
• 實(shí)驗(yàn)材料31-35
• 一、實(shí)驗(yàn)樣本31
• 二、免疫組化試劑31
• 三、Western-Wot試劑31-32
• 四、PCR試劑32
• 五、質(zhì)粒與小干擾RNA32-33
• 六、細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)主要試劑33
• 七、主要儀器設(shè)備33-35
• 實(shí)驗(yàn)方法35-43
• 一、細(xì)胞的培養(yǎng)及組織保存35
• 二、PCR35-37
• 三、Western-blot37-38
• 四、免疫組織化學(xué)38-39
• 五、脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染39
• 六、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)39-40
• 七、克隆/集落形成實(shí)驗(yàn)40
• 八、TIPE2對(duì)肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)力及侵襲力的影響40-41
• 九、TIPE2基因測(cè)序41
• 十、SiRNA轉(zhuǎn)染41-42
• 十一、機(jī)制研究42
• 十二、統(tǒng)計(jì)方法42-43
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-46
• 一、TIPE2在肺癌中的表達(dá)狀態(tài)和臨床意義43-44
• 二、TIPE2過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞惡性行為的影響44
• 三、肺癌細(xì)胞內(nèi)源性TIPE2基因的功能44-45
• 四、TIPE2通過(guò)抑制Rac信號(hào)通路發(fā)揮其抑癌功能45-46
• 討論46-48
• 結(jié)論48-49
• 附圖表-附表49-63
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 論文二：PDCD4基因?qū)細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞分化的影響65-89
• 前言65-69
• 一、PDCD4基因概述65-67
• 二、T淋巴細(xì)胞亞群概述67
• 三、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)亞群概述67-68
• 四、研究目的68-69
• 實(shí)驗(yàn)材料69-71
• 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物69
• 二、試劑和耗材69-70
• 三、主要實(shí)驗(yàn)儀器70-71
• 實(shí)驗(yàn)方法71-75
• 一、小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞懸液的制備71
• 二、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T、CD8+T和Foxp3+Treg細(xì)胞的比例變化71
• 三、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1、Th2和Th17細(xì)胞的比例變化71-72
• 四、小鼠骨髓細(xì)胞的分離72
• 五、DC的誘導(dǎo)72
• 六、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC表面分子的表達(dá)變化72-73
• 七、細(xì)胞因子的檢測(cè)73-74
• 八、一氧化氮(NO)水平的檢測(cè)74
• 九、RT-PCR74
• 十、Western blot74
• 十一、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析74-75
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-78
• 一、PDCD4基因?qū)淋巴細(xì)胞亞群分化的影響75-76
• 二、PDCD4對(duì)骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞分化的影響76-78
• 討論78-80
• 結(jié)論80-81
• 附圖81-86
• 參考文獻(xiàn)86-89
• 致謝89-90
• 攻讀學(xué)位期間主要科研成果90
• 獲獎(jiǎng)情況90-91
• 附表91

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  本文關(guān)鍵詞：免疫調(diào)節(jié)分子PDCD4和TIPE2在炎癥及腫瘤中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：372428