發(fā)布時間：2017-05-16 11:11

  本文關(guān)鍵詞：膜蛋白Flotillin-1與細胞膜朊蛋白PrP~C內(nèi)吞相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：朊病毒病,又稱可傳播性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是一類能夠感染人和動物神經(jīng)系統(tǒng)的致死性神經(jīng)退行性疾病,也稱為朊病毒病(prion diseases)。包括人類的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、Kuru病、家族性致死性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)以及GSS綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS),在動物中常見的有牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)、羊瘙癢病(Scrapie)以及鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。目前普遍認為其致病原為具有蛋白酶抗性以及高度感染性的異常朊蛋白(PrPSc),它是由生物體內(nèi)細胞PRNP基因編碼產(chǎn)生的正常朊蛋白PrPC發(fā)生了不可逆構(gòu)象轉(zhuǎn)化后形成,但具體形成機制仍不清楚。 盡管PrPSc是朊病毒病主要致病因子的觀點已被人們廣泛接受,但對其正常異構(gòu)體蛋白PrPC的生物學功能了解甚少。正常朊蛋白PrPC是一種廣泛表達于細胞膜上的磷脂酰肌醇(GPI)錨定糖蛋白,有報道稱,PrPc可能是某些神經(jīng)細胞的營養(yǎng)因子,與神經(jīng)細胞的生長分化有關(guān)；PrPC參與了細胞間黏附、識別以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；并且與細胞抗凋亡過程以及細胞內(nèi)金屬離子的轉(zhuǎn)運和代謝等生理活動密切相關(guān)。而PrPC的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運機制在PrPC實現(xiàn)諸如細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),金屬離子轉(zhuǎn)運等生理功能以及PrPc向PrPsc的轉(zhuǎn)化形成過程中都具有非常重要的作用,是其實現(xiàn)這些生理功能的基礎(chǔ)。但目前對PrPc內(nèi)吞機制的研究并不清楚,對其內(nèi)吞途徑的研究也一直存有爭論,主要的觀點認為PrPC的內(nèi)吞可能是由網(wǎng)格蛋白(Clathrin),小窩蛋白(Caveolin)或Arf6蛋白所介導(dǎo),但都沒有明確的定論,因此,對PrPc內(nèi)吞機制的研究勢必將有利于我們更好的認識PrPC正常生理功能以及對Prpsc形成機制的研究提供助力。 膜相關(guān)蛋白Flotillins,包括Flotillin-1(Flot-1)和Flotillin-2(Flot-2),二者在哺乳動物細胞中廣泛表達,有較高同源性,且均為SPFH超家族成員,這一類蛋白N端具有重復(fù)的谷氨酸和丙氨酸重復(fù)序列,稱為SPFH(Stomatin/Prohibitin/Flotillin/HflK/C)結(jié)構(gòu),但家族成員蛋白的功能并不是很清楚。目前的研究發(fā)現(xiàn)Flot-1/-2蛋白主要分布在細胞膜的脂質(zhì)微區(qū),能夠募集膜上的蛋白因子,為這些蛋白因子參與細胞各類生理活動提供反應(yīng)平臺,被稱作是細胞膜上的“腳手架”蛋白。有報道證實,膜相關(guān)蛋白Flotillin-1是一種新的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運蛋白,它在細胞中介導(dǎo)了一類完全不同于網(wǎng)經(jīng)格蛋白(Clathrin)所介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,并且研究表明該蛋白傾向于介導(dǎo)細胞膜上一類GPI錨定蛋白(如CD59、 Thy-1、GM1等)內(nèi)吞進入細胞,并且與細胞的內(nèi)吞生理活動密切相關(guān)。而該蛋白是否也參與了同樣是GPI錨定蛋自的PrPC的內(nèi)吞,目前還未有報道。 因此,本研究利用銅離子刺激細胞,建立PrPC內(nèi)吞的穩(wěn)定細胞模型,研究在這一過程中Flot-1蛋白與細胞PrPC內(nèi)吞的相關(guān)性。以期揭示Flot-1在PrPc內(nèi)吞機制中可能的作用,為更好的研究PrPC內(nèi)吞機制及其在生理活動中所起的作用提供一些幫助。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.在建立穩(wěn)定的銅離子刺激細胞PrPc內(nèi)吞的細胞模型過程中,證實在銅離子剌激PrpC內(nèi)吞過程中,細胞內(nèi)PrPc與Flot-1存在相互作用；并且這種相互作用現(xiàn)象的發(fā)生與銅離子濃度和銅離子刺激細胞的時間緊密相關(guān)。 2.證明了在已報道的能與PrPc結(jié)合的二價陽離子中,除二價銅離子外,二價鋅離子刺激細胞也能促使細胞內(nèi)Flot-1與PrPc發(fā)生相互作用,而其它二價陽離子處理細胞后并沒有檢測到兩蛋白之間相互作用的發(fā)生。 3.利用細胞免疫熒光實驗觀察到在銅離子刺激細胞PrPc內(nèi)吞過程中,Flot-1與PrPc在細胞內(nèi)有明顯的共定位以及共聚集現(xiàn)象。 4.利用RNAi技術(shù)干擾細胞內(nèi)源Flot-1蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)隨著Flot-1表達量的下降,PrPC在銅離子刺激下的內(nèi)吞活動受到了明顯的抑制。 5.利用銅離子刺激本身沒有PrPc內(nèi)源表達的細胞系—人胚腎細胞HEK293,細胞免疫熒光實驗沒有觀察到Flot-1進入細胞內(nèi)的現(xiàn)象,表明Flot-1蛋白可能是通過與PrpC蛋白相互作用的方式參與并介導(dǎo)銅離子刺激細胞PrPc內(nèi)吞的過程, 6.利用PrP八肽重復(fù)區(qū)缺失突變體(PrP-PGO)以及野生型PrP(PrP-PG5)分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞,并用細胞免疫熒光實驗觀察銅離子刺激細胞PrP內(nèi)吞過程中,發(fā)現(xiàn)PrP八肽重復(fù)區(qū)缺失后,PrP-PGO并不會發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象,且Flot-1與PrP-PGO在細胞內(nèi)也沒有共定位現(xiàn)象。而轉(zhuǎn)染的野生型PrP(PrP-PG5)依然會發(fā)生內(nèi)吞,且在內(nèi)吞過程中與F1ot-1依然存在明顯的共定位現(xiàn)象。 綜上所述,我們通過免疫印跡,免疫共沉淀,細胞免疫熒光,RNAi等一系列實驗方法證明了在銅離子刺激細胞PrPc內(nèi)吞過程中,Flot-1參與并介導(dǎo)了細胞膜PrPc的內(nèi)吞,進一步的實驗證明銅離子刺激Prpc內(nèi)吞與PrPc八肽重復(fù)區(qū)緊密相關(guān),因而我們認為PrPc八肽重復(fù)區(qū)結(jié)合銅離子后改變了PrPc本身的構(gòu)象,使得其與Flot-1更易發(fā)生相互作用,從而介導(dǎo)了PrPc內(nèi)吞進入細胞。
【關(guān)鍵詞】：朊病毒病 朊蛋白 flotillins 銅離子 內(nèi)吞
【學位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 引言11-18
• 實驗材料18-23
• 1.主要化學試劑18-19
• 2.分子量標準及試劑盒19
• 3.合成的三條Flot-lRNA干擾序列（GenePharma公司，，上海）19-20
• 4.質(zhì)粒載體20
• 5.細胞株20
• 6.培養(yǎng)基20
• 7.主要儀器及設(shè)備20-21
• 8.常用緩沖液及溶液21-23
• 實驗方法23-29
• 1.細胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染23-24
• 2.不同二價金屬陽離子處理細胞24
• 3.細胞裂解產(chǎn)物的制備及蛋白濃度的測定24-25
• 4.免疫共沉淀實驗及Western Blot檢測25-26
• 5.細胞免疫焚光染色26-27
• 6.細胞膜蛋白及胞i}蛋白的分步提取27-28
• 7.統(tǒng)計學處理28-29
• 實驗結(jié)果29-45
• 討論45-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻50-57
• 綜述57-64
• 參考文獻61-64
• 縮略詞對照表64-66
• 個人簡歷66-69
• 致謝69-70
• 附錄70

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Li-Li QING;Hui ZHAO;Lin-Lin LIU;;Progress on low susceptibility mechanisms of transmissible spongiform encephalopathies[J];動物學研究;2014年05期

2 霍佳;錢俊喬;李陳莉;j口京一;郭淺妤;錢金澤;;探討小鼠肌肉組織中老化淀粉樣變纖維的傳播性[J];中國人獸共患病學報;2014年12期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 刁小龍;雞朊蛋白參與DF-1細胞增殖粘附的功能研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2013年

2 章志宏;重組朊病毒的體外制備及動物模型研究[D];華東師范大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 朱淼;銅離子對朊蛋白轉(zhuǎn)基因線蟲的影響[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2013年

2 李雅楠;蘆丁和Anti-XD5分別對IAPP和β-淀粉樣蛋白影響的研究[D];寧夏大學;2013年

3 白換力;姜黃素和阿魏酸抑制朊病毒復(fù)制作用的研究[D];吉林大學;2014年

  本文關(guān)鍵詞：膜蛋白Flotillin-1與細胞膜朊蛋白PrP~C內(nèi)吞相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：370674