本文關(guān)鍵詞：膜蛋白Flotillin-1與細(xì)胞膜朊蛋白PrP~C內(nèi)吞相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：朊病毒病,又稱可傳播性海綿狀腦病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是一類能夠感染人和動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的致死性神經(jīng)退行性疾病,也稱為朊病毒病(prion diseases)。包括人類的克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、Kuru病、家族性致死性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)以及GSS綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS),在動(dòng)物中常見的有牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)、羊瘙癢病(Scrapie)以及鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。目前普遍認(rèn)為其致病原為具有蛋白酶抗性以及高度感染性的異常朊蛋白(PrPSc),它是由生物體內(nèi)細(xì)胞PRNP基因編碼產(chǎn)生的正常朊蛋白PrPC發(fā)生了不可逆構(gòu)象轉(zhuǎn)化后形成,但具體形成機(jī)制仍不清楚。 盡管PrPSc是朊病毒病主要致病因子的觀點(diǎn)已被人們廣泛接受,但對其正常異構(gòu)體蛋白PrPC的生物學(xué)功能了解甚少。正常朊蛋白PrPC是一種廣泛表達(dá)于細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇(GPI)錨定糖蛋白,有報(bào)道稱,PrPc可能是某些神經(jīng)細(xì)胞的營養(yǎng)因子,與神經(jīng)細(xì)胞的生長分化有關(guān)；PrPC參與了細(xì)胞間黏附、識(shí)別以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；并且與細(xì)胞抗凋亡過程以及細(xì)胞內(nèi)金屬離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等生理活動(dòng)密切相關(guān)。而PrPC的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制在PrPC實(shí)現(xiàn)諸如細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生理功能以及PrPc向PrPsc的轉(zhuǎn)化形成過程中都具有非常重要的作用,是其實(shí)現(xiàn)這些生理功能的基礎(chǔ)。但目前對PrPc內(nèi)吞機(jī)制的研究并不清楚,對其內(nèi)吞途徑的研究也一直存有爭論,主要的觀點(diǎn)認(rèn)為PrPC的內(nèi)吞可能是由網(wǎng)格蛋白(Clathrin),小窩蛋白(Caveolin)或Arf6蛋白所介導(dǎo),但都沒有明確的定論,因此,對PrPc內(nèi)吞機(jī)制的研究勢必將有利于我們更好的認(rèn)識(shí)PrPC正常生理功能以及對Prpsc形成機(jī)制的研究提供助力。 膜相關(guān)蛋白Flotillins,包括Flotillin-1(Flot-1)和Flotillin-2(Flot-2),二者在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá),有較高同源性,且均為SPFH超家族成員,這一類蛋白N端具有重復(fù)的谷氨酸和丙氨酸重復(fù)序列,稱為SPFH(Stomatin/Prohibitin/Flotillin/HflK/C)結(jié)構(gòu),但家族成員蛋白的功能并不是很清楚。目前的研究發(fā)現(xiàn)Flot-1/-2蛋白主要分布在細(xì)胞膜的脂質(zhì)微區(qū),能夠募集膜上的蛋白因子,為這些蛋白因子參與細(xì)胞各類生理活動(dòng)提供反應(yīng)平臺(tái),被稱作是細(xì)胞膜上的“腳手架”蛋白。有報(bào)道證實(shí),膜相關(guān)蛋白Flotillin-1是一種新的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,它在細(xì)胞中介導(dǎo)了一類完全不同于網(wǎng)經(jīng)格蛋白(Clathrin)所介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,并且研究表明該蛋白傾向于介導(dǎo)細(xì)胞膜上一類GPI錨定蛋白(如CD59、 Thy-1、GM1等)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,并且與細(xì)胞的內(nèi)吞生理活動(dòng)密切相關(guān)。而該蛋白是否也參與了同樣是GPI錨定蛋自的PrPC的內(nèi)吞,目前還未有報(bào)道。 因此,本研究利用銅離子刺激細(xì)胞,建立PrPC內(nèi)吞的穩(wěn)定細(xì)胞模型,研究在這一過程中Flot-1蛋白與細(xì)胞PrPC內(nèi)吞的相關(guān)性。以期揭示Flot-1在PrPc內(nèi)吞機(jī)制中可能的作用,為更好的研究PrPC內(nèi)吞機(jī)制及其在生理活動(dòng)中所起的作用提供一些幫助。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.在建立穩(wěn)定的銅離子刺激細(xì)胞PrPc內(nèi)吞的細(xì)胞模型過程中,證實(shí)在銅離子剌激PrpC內(nèi)吞過程中,細(xì)胞內(nèi)PrPc與Flot-1存在相互作用；并且這種相互作用現(xiàn)象的發(fā)生與銅離子濃度和銅離子刺激細(xì)胞的時(shí)間緊密相關(guān)。 2.證明了在已報(bào)道的能與PrPc結(jié)合的二價(jià)陽離子中,除二價(jià)銅離子外,二價(jià)鋅離子刺激細(xì)胞也能促使細(xì)胞內(nèi)Flot-1與PrPc發(fā)生相互作用,而其它二價(jià)陽離子處理細(xì)胞后并沒有檢測到兩蛋白之間相互作用的發(fā)生。 3.利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到在銅離子刺激細(xì)胞PrPc內(nèi)吞過程中,Flot-1與PrPc在細(xì)胞內(nèi)有明顯的共定位以及共聚集現(xiàn)象。 4.利用RNAi技術(shù)干擾細(xì)胞內(nèi)源Flot-1蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)隨著Flot-1表達(dá)量的下降,PrPC在銅離子刺激下的內(nèi)吞活動(dòng)受到了明顯的抑制。 5.利用銅離子刺激本身沒有PrPc內(nèi)源表達(dá)的細(xì)胞系—人胚腎細(xì)胞HEK293,細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)沒有觀察到Flot-1進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象,表明Flot-1蛋白可能是通過與PrpC蛋白相互作用的方式參與并介導(dǎo)銅離子刺激細(xì)胞PrPc內(nèi)吞的過程, 6.利用PrP八肽重復(fù)區(qū)缺失突變體(PrP-PGO)以及野生型PrP(PrP-PG5)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察銅離子刺激細(xì)胞PrP內(nèi)吞過程中,發(fā)現(xiàn)PrP八肽重復(fù)區(qū)缺失后,PrP-PGO并不會(huì)發(fā)生內(nèi)吞現(xiàn)象,且Flot-1與PrP-PGO在細(xì)胞內(nèi)也沒有共定位現(xiàn)象。而轉(zhuǎn)染的野生型PrP(PrP-PG5)依然會(huì)發(fā)生內(nèi)吞,且在內(nèi)吞過程中與F1ot-1依然存在明顯的共定位現(xiàn)象。 綜上所述,我們通過免疫印跡,免疫共沉淀,細(xì)胞免疫熒光,RNAi等一系列實(shí)驗(yàn)方法證明了在銅離子刺激細(xì)胞PrPc內(nèi)吞過程中,Flot-1參與并介導(dǎo)了細(xì)胞膜PrPc的內(nèi)吞,進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明銅離子刺激Prpc內(nèi)吞與PrPc八肽重復(fù)區(qū)緊密相關(guān),因而我們認(rèn)為PrPc八肽重復(fù)區(qū)結(jié)合銅離子后改變了PrPc本身的構(gòu)象,使得其與Flot-1更易發(fā)生相互作用,從而介導(dǎo)了PrPc內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：朊病毒病 朊蛋白 flotillins 銅離子 內(nèi)吞
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 引言11-18
• 實(shí)驗(yàn)材料18-23
• 1.主要化學(xué)試劑18-19
• 2.分子量標(biāo)準(zhǔn)及試劑盒19
• 3.合成的三條Flot-lRNA干擾序列（GenePharma公司，，上海）19-20
• 4.質(zhì)粒載體20
• 5.細(xì)胞株20
• 6.培養(yǎng)基20
• 7.主要儀器及設(shè)備20-21
• 8.常用緩沖液及溶液21-23
• 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 1.細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染23-24
• 2.不同二價(jià)金屬陽離子處理細(xì)胞24
• 3.細(xì)胞裂解產(chǎn)物的制備及蛋白濃度的測定24-25
• 4.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及Western Blot檢測25-26
• 5.細(xì)胞免疫焚光染色26-27
• 6.細(xì)胞膜蛋白及胞i}蛋白的分步提取27-28
• 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理28-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-45
• 討論45-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 綜述57-64
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 縮略詞對照表64-66
• 個(gè)人簡歷66-69
• 致謝69-70
• 附錄70

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Li-Li QING;Hui ZHAO;Lin-Lin LIU;;Progress on low susceptibility mechanisms of transmissible spongiform encephalopathies[J];動(dòng)物學(xué)研究;2014年05期

2 霍佳;錢俊喬;李陳莉;j口京一;郭淺妤;錢金澤;;探討小鼠肌肉組織中老化淀粉樣變纖維的傳播性[J];中國人獸共患病學(xué)報(bào);2014年12期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 刁小龍;雞朊蛋白參與DF-1細(xì)胞增殖粘附的功能研究[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 章志宏;重組朊病毒的體外制備及動(dòng)物模型研究[D];華東師范大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 朱淼;銅離子對朊蛋白轉(zhuǎn)基因線蟲的影響[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2013年

2 李雅楠;蘆丁和Anti-XD5分別對IAPP和β-淀粉樣蛋白影響的研究[D];寧夏大學(xué);2013年

3 白換力;姜黃素和阿魏酸抑制朊病毒復(fù)制作用的研究[D];吉林大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：膜蛋白Flotillin-1與細(xì)胞膜朊蛋白PrP~C內(nèi)吞相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：370674