本文關鍵詞：克里米亞—剛果出血熱病毒（CCHFV）核蛋白的表達純化、結(jié)晶、結(jié)構(gòu)及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：克里米亞-剛果出血熱(Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF)是一種致死率達30%-50%的蜱傳播的傳染病,在世界各地廣泛流行,已經(jīng)在非洲、歐洲、亞洲等的30多個國家和地區(qū)都有報道。1965年我國首位病例出現(xiàn)在新疆巴楚縣,也稱為新疆出血熱,致死率高達80%,主要集中于我國的西南和西北地區(qū)�？死锩讈�-剛果出血熱主要有兩種感染途徑：一是通過蜱類直接叮咬,二是通過皮膚傷口感染。臨床癥狀一般為發(fā)熱、頭痛、嘔吐、出血、肝腎衰竭等。目前沒有有效的治療手段。該病是由于感染克里米亞-剛果出血熱病毒(CCHFV)引起的,CCHFV是負鏈RNA病毒,屬于布尼亞病毒科內(nèi)羅病毒屬,基因組RNA包括L、M、S三段,分別編碼RNA聚合酶、糖蛋白和核蛋白(NP)。該病毒的傳播性強,被認為有被恐怖分子利用的危險,CCHFV已被列為生物安全四級病原體(BSL-4)。迄今為止,針對CCHFV的基礎研究還很缺乏。 CCHFV核蛋白(Nucleoprote in, NP)結(jié)合病毒的基因組RNA,形成核蛋白-RNA復合物(RNP),能參與病毒RNA復制、衣殼化及病毒粒子裝配等重要過程。病毒的核蛋白還能與病毒蛋白及宿主細胞內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用來保護自身干擾細胞正常功能。 本論文以CCHFV NP為研究對象,對核蛋白進行表達、純化、結(jié)晶等工作。我們首先將核蛋白的全長基因構(gòu)建到原核表達載體,在大腸桿菌系統(tǒng)表達目的蛋白,進一步純化,通過大量結(jié)晶條件的篩選獲得該蛋白的晶體。利用X-ray衍射收集了2.3A的衍射數(shù)據(jù),解析晶體結(jié)構(gòu)。與其他報道的負鏈RNA病毒核蛋白結(jié)構(gòu)不同,CCHFV NP的結(jié)構(gòu)明顯具有頭部和桿部兩個結(jié)構(gòu)域,整體像“球拍”。在此基礎上,對CCHFV NP進行了進一步的功能研究,包括CCHFV NP在體外的聚集狀態(tài)、NP和RNA的結(jié)合強弱、NP和宿主細胞蛋白Caspse3的相互作用、特異的DNA核酸酶活性等諸多方面。 因此,針對CCHFV核蛋白進行的結(jié)構(gòu)和功能方面的研究,不但可以為闡明病毒的復制轉(zhuǎn)錄機制提供直接可靠的結(jié)構(gòu)基礎,而且可以為這一傳染病的防控與治療提供可靠的靶點。
【關鍵詞】：克里米亞-剛果出血熱病毒 核蛋白 蛋白三維結(jié)構(gòu)
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373.32
【目錄】：

• 摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 目錄9-12
• 符號說明12-13
• 第一章 克里米亞-剛果出血熱病毒的核蛋白研究背景13-28
• 第一節(jié) 克里米亞-剛果出血熱病毒的研究現(xiàn)狀13-17
• 1.1.1 克里米亞-剛果出血熱簡介13-14
• 1.1.2 克里米亞-剛果出血熱病毒概況14-16
• 1.1.3 克里米亞-剛果出血熱病毒的檢測16
• 1.1.4 克里米亞-剛果出血熱的治療和控制16-17
• 第二節(jié) 布尼亞病毒科研究概況17-20
• 1.2.1 布尼亞病毒科的成員17
• 1.2.2 布尼亞病毒的結(jié)構(gòu)及基因結(jié)構(gòu)特征17-19
• 1.2.3 布尼亞病毒科病毒的生活周期19-20
• 1.2.4 布尼亞病毒科引發(fā)的疾病20
• 第三節(jié) 核蛋白的研究進展20-28
• 1.3.1 核蛋白在病毒生活周期中的作用20-21
• 1.3.2 幾種負鏈RNA病毒核蛋白的研究概況21-27
• 1.3.3 克里米亞-剛果出血熱核蛋白的研究意義27-28
• 第二章 主要實驗過程28-43
• 第一節(jié) CCHFV NP的蛋白體外表達28-33
• 2.1.1 蛋白體外表達的原理28
• 2.1.2 實驗材料28-29
• 2.1.3 實驗方法29-33
• 第二節(jié) CCHFV NP的蛋白純化33-36
• 2.2.1 蛋白純化的原則和方法33-35
• 2.2.2 實驗材料35
• 2.2.3 實驗方法35-36
• 第三節(jié) CCHFV NP的結(jié)晶36-43
• 2.3.1 蛋白質(zhì)結(jié)晶的原理和方法37-40
• 2.3.2 實驗材料40-41
• 2.3.3 實驗方法41-43
• 第三章 CCHFV NP三維結(jié)構(gòu)的研究43-54
• 第一節(jié) CCHFV NP表達、純化和結(jié)晶的結(jié)果43-46
• 3.1.1 CCHFV NP的表達結(jié)果43-44
• 3.1.2 CCHFV NP的純化結(jié)果44-45
• 3.1.3 CCHFV NP的結(jié)晶結(jié)果45-46
• 第二節(jié) 硒代甲硫氨酸CCHFV NP晶體的獲得46-50
• 3.2.1 硒代甲硫氨酸的原理46
• 3.2.2 實驗試劑配方及處理46-48
• 3.2.3 實驗過程48
• 3.2.4 硒代CCHFV NP純化和結(jié)晶結(jié)果48-50
• 第三節(jié) 數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析50-54
• 3.3.1 X射線衍射的原理50-51
• 3.3.2 數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)解析51-52
• 3.3.3 CCHFV NP的三維結(jié)構(gòu)52-54
• 第四章 CCHFV NP的功能研究54-67
• 第一節(jié) CCHFV NP的體外聚合狀態(tài)54-55
• 第二節(jié) CCHFV NP與mRNA帽子的結(jié)合能力的分析55-57
• 4.2.1 通過等溫量熱滴定實驗測定CCHFV NP與mRNA帽子類似物的結(jié)合55-57
• 4.2.2 晶體浸泡探索CCHFV NP與mRNA帽子的結(jié)合能力57
• 第三節(jié) 探究CCHFV NP與RNA的結(jié)合57-60
• 4.3.1 核酸酶對CCHFV NP結(jié)合天然核酸的能力的影響57-59
• 4.3.2 利用EMSA分析CCHFV NP與RNA的結(jié)合能力59-60
• 第四節(jié) CCHFV NP與Caspase3的相互作用60-61
• 第五節(jié) CCHFV NP特異的DNA核酸內(nèi)切酶活性61-67
• 4.5.1 CCHFV NP的核酸酶活性具有金屬依賴性62
• 4.5.2 CCHFV NP具有特異的DNA核酸酶活性62-63
• 4.5.3 CCHFV NP具有特異的DNA核酸內(nèi)切酶活性63-65
• 4.5.4 CCHFV NP核酸酶酶活性位點的確定65-67
• 第五章 全文總結(jié)67-68
• 參考文獻68-71
• 致謝71-72
• 附錄72-73
• 個人簡歷73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 曹蕾;唐青;陶曉燕;黃瑩;杜加亮;張守峰;扈榮良;;狂犬病病毒N基因的桿狀病毒表達及鑒定[J];病毒學報;2010年05期

2 唐青;;克里米亞-剛果出血熱研究狀況與進展[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2006年01期

3 王穎;邵柏;于長友;方紹慶;劉明杰;孫寶杰;;布尼亞病毒科概述[J];中國媒介生物學及控制雜志;2012年02期

4 相大鵬;師永霞;李小波;;新疆出血熱的研究進展[J];中國醫(yī)藥生物技術;2009年01期

5 王樹成,米保國,曹燮政;克里米亞 - 剛果出血熱[J];中國獸醫(yī)雜志;1998年03期

  本文關鍵詞：克里米亞—剛果出血熱病毒（CCHFV）核蛋白的表達純化、結(jié)晶、結(jié)構(gòu)及功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：368588