發(fā)布時間：2022-07-12 17:26

　　人FL（flt3 ligand）是近年發(fā)現(xiàn)的重要造血細胞因子，其功能類似于hSCF，主要作用于早期原始的干／祖細胞，促進其增殖和分化，與其它細胞因子聯(lián)合應用，可產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用。與hSCF不同的是，hFL對肥大細胞沒有作用，沒有種屬特異性，并且可顯著刺激樹突狀細胞（DC）和自然殺傷細胞（NK）的增殖。這些功能使FL在造血系統(tǒng)原發(fā)性或繼發(fā)性損傷疾病的治療、造血干細胞移植，特別是在腫瘤免疫基因治療和免疫疫苗制備等方面具有重要的潛在應用價值。DCs細胞作為功能最強的抗原提呈細胞（APC），在免疫應答反應中起著關鍵作用，能誘導非特異性先天免疫反應和特異性獲得免疫反應。利用FL擴增DCs的抗腫瘤免疫治療效果，在動物模型中已得到驗證。本研究利用hFL能顯著刺激體內DCs增殖的生物學特性，用基因工程方法表達重組hFL，對小鼠種植瘤進行抑瘤效果試驗，為進一步研究hFL在腫瘤免疫治療中的有效作用提供實驗依據(jù)。本論文主要包括兩部分內容： 一、應用酵母表達系統(tǒng)，表達分泌性人FL（hFL）的K84E／Q122R突變體。hFL第84位和122位氨基酸的密碼子分別改造為E和R的密碼子，并在N端采用甲醇酵母... 

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
圖表目錄
中文摘要
Abstract
英文略語表
前言
第一部分 人FL在甲醇酵母中表達、純化、體外活性測定及小鼠抗腫瘤實驗
    1 實驗材料
        1.1 實驗動物
        1.2 菌株
        1.3 質粒
        1.4 工具酶
        1.5 主要化學試劑
        1.6 細胞培養(yǎng)試劑和消耗材料
        1.7 其它材料
        1.8 主要儀器及設備
        1.9 培養(yǎng)基的配制
        1.10 主要溶液配方
        1.11 引物
    2 實驗方法
        2.1 表達質粒的構建
        2.2 重組蛋白在Pichia pastoris中的表達及純化
        2.3 重組蛋白理化性質測定
        2.4 重組蛋白體外活性測定
        2.5 鼠皮下移植EL4淋巴瘤模型的治療實驗
    3 實驗結果
        3.1 人FL基因的獲得
        3.2 重組表達質粒pPIC9K-hFL的構建
        3.3 重組蛋白在Pichia pastoris中的表達及純化
        3.4 hFL理化性質測定
        3.5 hFL體外活性測定
        3.6 重組蛋白體內抗腫瘤實驗
    4 討論
        4.1 甲醇酵母高表達轉化子的篩選方法
        4.2 hFL表達條件優(yōu)選
        4.3 hFL的糖基化
        4.4 hFL活性檢測
第二部分 腺病毒介導人FL和人GM-CSF聯(lián)合基因治療惡性腫瘤
    5 實驗材料
        5.1 細胞系
        5.2 菌株
        5.3 質粒
        5.4 其它材料
        5.5 引物
    6 實驗方法
        6.1 重組腺病毒pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP的構建
        6.2 體內外表達量測定
        6.3 體外活性測定
        6.4 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因擴增脾臟樹突狀細胞
        6.5 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因治療惡性腫瘤
    7 實驗結果
        7.1 高滴度重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF和Ad-GFP的制備
        7.2 體內外表達量測定
        7.3 體外活性測定
        7.4 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因擴增脾臟樹突狀細胞
        7.5 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因治療惡性腫瘤
        7.6 腫瘤組織病理切片
    8 討論
        8.1 穿梭質粒的改造與構建
        8.2 細菌內同源重組
        8.3 重組腺病毒的包裝
        8.4 重組腺病毒表達hFL和hGM-CSF及體內外活性實驗
小結
論文參考文獻
綜述一：FL在骨髓的造血和免疫功能調控中的作用
綜述二：靶向腺病毒載體
綜述三：造血干細胞基因治療研究進展
綜述四：真核DNA復制機制的研究進展
博士期間發(fā)表論文、綜述及專利情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]瘤內注射攜帶Flt3配體的重組腺病毒治療小鼠肝癌[J]. 楊慶,楊廣順,衛(wèi)立辛,楊寧,賈鳳歧,吳孟超.  中華實驗外科雜志. 2002(04)
[2]腺病毒介導的小鼠Flt3配體抗肝癌基因治療的研究[J]. 楊慶,楊廣順,衛(wèi)立辛,賈鳳岐,吳孟超,郭亞軍.  中華醫(yī)學雜志. 2002(11)
[3]人FL在大腸桿菌中的表達及表達產(chǎn)物的純化和生物學活性測定[J]. 張友鴻,周希亞,陳松森,婁可佳,劉深基,楊克恭,何維.  基礎醫(yī)學與臨床. 2002(02)
[4]人FL基因高效真核表達載體的構建及其在COS-7細胞中的表達[J]. 王冠軍,馬俐君,李梁,裴雪濤.  中國免疫學雜志. 2001(06)
[5]人白細胞介素-17基因的克隆、表達及其表達產(chǎn)物的分離純化[J]. 王建勛,陳松森,狄旭,宋衛(wèi)華.  中國生物化學與分子生物學報. 1999(03)
[6]腺病毒載體效能改進[J]. 徐敏毅.  中國腫瘤生物治療雜志. 1999(01)
[7]人干細胞因子cDNA克隆及其在大腸桿菌中的高效表達[J]. 陳衛(wèi)東,狄旭,李江,宋飛,陳松森,梁植權.  中國醫(yī)學科學院學報. 1997(01)
[8]人胎肝FLT3配基膜外區(qū)基因的克隆及其在COS-7細胞中的表達[J]. 周生,毛寧,劉元林,杜德林,唐佩弦,潘凌亞.  實驗血液學雜志. 1996(03)



本文編號：3659544