本文關(guān)鍵詞：運(yùn)用獼猴模型評(píng)估反復(fù)促排卵對(duì)卵巢結(jié)構(gòu)和功能的遠(yuǎn)期影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：世界首例試管嬰兒Louis Brown于1978年順利降生,此后30余年來,輔助生殖技術(shù)(Assisted Reproductive Technology, ART)不斷成熟和發(fā)展,并在全世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用,為廣大不孕不育患者及家庭帶來了福音。為提高ART的妊娠機(jī)率,臨床上常使用控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH),即使用外源性卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)制劑來促使卵巢內(nèi)多個(gè)卵泡共同發(fā)育,由此獲得更多的胚胎進(jìn)行移植。然而有些不孕患者在接受一次促排卵治療后并不能成功妊娠,而需要接受多次促排卵周期。隨之而來,反復(fù)控制性促排卵治療在誘導(dǎo)排卵過程中發(fā)生的副反應(yīng)及其治療后對(duì)子代和母體的健康隱患也越來越受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。其中,控制性超促排卵(COH)治療是否會(huì)對(duì)女性身體健康尤其是卵巢的結(jié)構(gòu)功能造成影響已成為不可忽視的問題,雖然目前已有一些相關(guān)的促排卵治療安全性評(píng)估報(bào)道,但尚無統(tǒng)一結(jié)論。這些評(píng)估大多是針對(duì)臨床病例的調(diào)查性研究,缺乏對(duì)COH遠(yuǎn)期影響的評(píng)估,并且無法進(jìn)行機(jī)制探討。因此,系統(tǒng)評(píng)估反復(fù)促排卵治療對(duì)卵巢的遠(yuǎn)期影響及其機(jī)制仍是重要課題。 獼猴作為靈長類動(dòng)物,與人類具有許多極為相似的生理學(xué)特性,尤其是雌性獼猴的月經(jīng)周期和人類非常類似,因此便成為研究生育調(diào)控機(jī)制及了解生殖機(jī)理的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本研究以中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所提供的6只靈長類動(dòng)物獼猴為模型,促排組和正常組各3只。促排組獼猴曾接受反復(fù)促排卵治療4個(gè)周期,間隔5年后用于本研究；正常組為同年齡、未接受過促排卵治療的正常獼猴。運(yùn)用形態(tài)學(xué),分子生物學(xué),蛋白質(zhì)組學(xué)等對(duì)兩組獼猴卵巢的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行評(píng)估和比較,探討反復(fù)多次促排卵治療間隔多年后對(duì)卵巢的遠(yuǎn)期影響。 首先對(duì)卵巢組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,結(jié)果顯示：促排組卵巢和正常組卵巢肉眼觀察均無腫瘤樣改變。各級(jí)卵泡在兩組卵巢組織切片中均可見,不同發(fā)育階段的卵泡占卵巢內(nèi)總卵泡百分比在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是次級(jí)卵泡、有腔卵泡及閉鎖卵泡所占卵泡百分比在促排組內(nèi)有上升趨勢(shì)。電鏡觀察卵泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示,促排組卵泡顆粒細(xì)胞存在較多的線粒體異常改變,表現(xiàn)為線粒體嵴模糊,基質(zhì)降解和空泡化改變。 進(jìn)一步對(duì)卵巢功能進(jìn)行評(píng)估,因?yàn)槁殉簿哂挟a(chǎn)生配子和分泌生殖激素的作用,所以我們分別對(duì)卵泡的細(xì)胞增殖凋亡狀態(tài)、卵母細(xì)胞的生長發(fā)育狀態(tài)、血清激素水平及參與激素合成的關(guān)鍵酶和分子表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估。結(jié)果顯示：①運(yùn)用ki67, TUNEL等方法檢測(cè)卵泡內(nèi)細(xì)胞的增殖和凋亡,顯示Ki67陽性信號(hào)和TUNEL陽性信號(hào)都主要定位于顆粒細(xì)胞；對(duì)陽性信號(hào)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),Ki67陽性卵泡數(shù)／總卵泡數(shù)的比率,以及TUNEL陽性顆粒細(xì)胞數(shù)／總卵泡數(shù)的比率在兩組問均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②通過檢測(cè)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞特異性表達(dá)基因來判斷卵母細(xì)胞發(fā)育狀態(tài),這些基因在卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育、受精以及早期胚胎發(fā)育過程中都發(fā)揮著重要的作用。結(jié)果顯示：與正常組相比,我們檢測(cè)的5個(gè)卵母細(xì)胞特異表達(dá)基因在促排組卵巢中的表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③月經(jīng)周期的第3天和第10天,血清中雌二醇、孕酮及卵泡刺激素水平在促排組和正常組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；參與激素合成的關(guān)鍵因子——類固醇激素快速合成調(diào)節(jié)蛋白(StAR)和芳香化酶(CYP19A1)在促排組卵巢中的表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。以上結(jié)果提示反復(fù)促排卵治療可能對(duì)卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的發(fā)育和功能有著遠(yuǎn)期的不良影響,潛在影響其激素合成能力。 最后,我們運(yùn)用TMT標(biāo)記后液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜的技術(shù)平臺(tái),比對(duì)正常組和促排卵組卵巢的蛋白質(zhì)表達(dá),通過對(duì)差異蛋白質(zhì)的分析,試圖從分子水平評(píng)估反復(fù)促排卵對(duì)卵巢造成的影響及可能機(jī)制。結(jié)果顯示：我們共鑒定出79個(gè)差異蛋白(P0.05),其中1.5倍以上差異蛋白共51個(gè)；在這51個(gè)差異蛋白中,43個(gè)蛋白在促排卵組中表達(dá)下調(diào),8個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)卵巢內(nèi)差異蛋白主要定位于線粒體和細(xì)胞溶質(zhì),這可能與本研究發(fā)現(xiàn)的促排組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中較多的線粒體異常改變有關(guān),也與既往研究報(bào)道的反復(fù)促排卵后會(huì)出現(xiàn)線粒體損傷相吻合。通過對(duì)差異蛋白的以往文獻(xiàn)報(bào)道檢索后發(fā)現(xiàn),促排組這些差異蛋白的表達(dá)水平改變對(duì)卵巢內(nèi)各細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡,抑制增殖和分化。此外,相當(dāng)部分的差異蛋白(56.8%)在以往的腫瘤研究中有過報(bào)道,提示這些蛋白水平的改變可能與腫瘤發(fā)展有一定的相關(guān)性。 綜上所述,反復(fù)促排間隔多年后依然會(huì)影響卵巢內(nèi)一系列蛋白質(zhì)的表達(dá),而這些蛋白水平的改變對(duì)卵巢內(nèi)各細(xì)胞的影響主要表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡,抑制增殖和分化,對(duì)卵巢整體呈現(xiàn)為負(fù)性作用。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)卵巢在反復(fù)促排間隔多年后發(fā)生明顯的異常改變,但對(duì)卵巢進(jìn)行分子水平以及超微結(jié)構(gòu)觀察,發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)出低發(fā)育潛能的趨勢(shì),表現(xiàn)為線粒體異常改變,以及參與激素合成的關(guān)鍵因子和酶表達(dá)水平下降。
【關(guān)鍵詞】：控制性超促排卵 卵巢 卵泡結(jié)構(gòu) 卵泡功能 獼猴 蛋白質(zhì)組
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R-332;R714.8
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-32
• 一、實(shí)驗(yàn)材料14-18
• 二、實(shí)驗(yàn)方法18-32
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-51
• 1. 卵巢成瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估32-35
• 1.1 肉眼下卵巢大體結(jié)構(gòu)觀察32
• 1.2 光鏡下組織結(jié)構(gòu)整體觀察32-33
• 1.3 卵巢上皮增殖狀態(tài)評(píng)估33-35
• 2. 卵巢卵泡形態(tài)學(xué)分析35-37
• 2.1 光鏡下卵泡組織結(jié)構(gòu)觀察35-37
• 2.2 電鏡下卵泡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察37
• 3. 卵巢卵泡功能評(píng)估37-42
• 3.1 卵泡的細(xì)胞增殖和凋亡38-40
• 3.2 卵母細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)40-41
• 3.3 卵泡細(xì)胞激素合成能力評(píng)估41-42
• 4. 正常組和促排組獼猴卵巢組織差異蛋白質(zhì)的鑒定,驗(yàn)證和功能分析42-51
• 4.1 正常組和促排組卵巢組織中差異蛋白的鑒定和整體分析42-48
• 4.2 運(yùn)用western blot驗(yàn)證差異蛋白在兩組卵巢中的表達(dá)水平48
• 4.3 運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)差異蛋白功能進(jìn)行分析48-51
• 討論51-57
• 1.卵巢成瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估51-53
• 2.卵巢形態(tài)學(xué)觀察分析53
• 3.卵巢功能評(píng)估53-55
• 4.促排組中差異蛋白質(zhì)的鑒定、驗(yàn)證和分析55-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 綜述62-81
• 參考文獻(xiàn)72-81
• 碩士在讀期間發(fā)表論文81-82
• 致謝82

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本文編號(hào)：365860