本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效分泌表達(dá)外源蛋白，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因是生物機(jī)體遺傳信息的儲(chǔ)存、復(fù)制和表達(dá)的攜帶者,蛋白質(zhì)是機(jī)體生命活動(dòng)的執(zhí)行者和體現(xiàn)者。進(jìn)入后基因組時(shí)代,生命科學(xué)研究?jī)H僅停留在核酸層面是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。雖然蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu),即氨基酸的數(shù)量、種類(lèi)及排列順序,是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ),由基因的核酸序列決定。不過(guò)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜和不規(guī)則的,目前的理論知識(shí)仍然無(wú)法完全正確的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)與功能,比如如何從其氨基酸序列折疊形成三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)仍然是未知的。如果要對(duì)一個(gè)基因進(jìn)行研究,首先必須通過(guò)重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)獲得足夠量的目的蛋白,才能對(duì)該蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。因此,蛋白質(zhì)是科學(xué)研究的原材料,重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)是生命科學(xué)研究的助推器。 重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),其中每個(gè)系統(tǒng)有其各自的特點(diǎn),目前應(yīng)用比較廣泛的是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。每個(gè)重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)分述如下： 大腸菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是遺傳背景研究清楚,操作方便,生產(chǎn)成本低,重組蛋白表達(dá)量高；缺點(diǎn)是缺乏糖基化等蛋白修飾功能,無(wú)法生產(chǎn)表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白,重組蛋白多數(shù)無(wú)法形成正確的折疊,常以不溶性包涵體的形式表達(dá),需要體外再折疊來(lái)恢復(fù)活性。 酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核生物和真核生物的特點(diǎn),可以迅速生長(zhǎng),正確加工修飾重組蛋白,重組蛋白表達(dá)量高；缺點(diǎn)是具有密碼子偏向性,對(duì)外源基因的序列有特定要求,無(wú)法加工修飾結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的外源蛋白。 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(比如桿狀病毒介導(dǎo))優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)表達(dá)量相對(duì)較高,具有比較完善的翻譯后加工修飾功能。不過(guò)其糖基化的寡糖鏈與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的不一樣,并且無(wú)法識(shí)別裂解很多蛋白前體。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有非常完善的糖基化修飾功能、折疊機(jī)制,可以理想地翻譯后加工、修飾、分泌重組蛋白。目前存在問(wèn)題是表達(dá)量低、基因表達(dá)調(diào)控復(fù)雜、下游純化相對(duì)困難等。 外源蛋白的有效表達(dá)需要選擇合適的表達(dá)系統(tǒng),必須考慮蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、實(shí)驗(yàn)要求、技術(shù)條件等因素。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)雖然外源基因表達(dá)量低,卻可以正確表達(dá)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的外源蛋白,使重組蛋白的結(jié)構(gòu)接近其天然結(jié)構(gòu)。比如,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗原蛋白具有良好的免疫原性從而提高免疫診斷準(zhǔn)確率。因此,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是目前發(fā)展的主流方向。有兩種方法可以介導(dǎo)外源基因進(jìn)入細(xì)胞：一種是病毒感染介導(dǎo),比如腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等；一種是采用化學(xué)方法(比如脂質(zhì)體、磷酸鈣、PEI等)或者物理方法(例如顯微注射、電穿孔等)直接將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。 腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒,基因組長(zhǎng)約25-45kb,理論上可編碼22-40個(gè)基因,衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu),直徑80-110nm。腺病毒載體系統(tǒng)廣泛用于人類(lèi)蛋白和非人類(lèi)蛋白的表達(dá),具有宿主范圍廣、可以感染一系列動(dòng)物細(xì)胞,對(duì)人致病性低,可在增值細(xì)胞和非增值細(xì)胞感染表達(dá),不整合到細(xì)胞基因組、無(wú)基因突變與致癌風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)腺病毒可以編碼表達(dá)多個(gè)外源基因,以及腺病毒可以在特定細(xì)胞高效擴(kuò)增,容易獲得高滴度(1012PFU/ml)的腺病毒,這使得腺病毒非常適合基因治療和體內(nèi)接種疫苗。 高效的真核分泌表達(dá)系統(tǒng)主要包括兩部分：高效分泌表達(dá)系統(tǒng)和宿主細(xì)胞。為了構(gòu)建高效分泌表達(dá)的腺病毒載體,引導(dǎo)重組蛋白高效率分泌到培養(yǎng)上清,方便于重組蛋白的純化。本研究在兩方面對(duì)外源基因在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的影響進(jìn)行探索性研究,比如信號(hào)肽置換與無(wú)血清培養(yǎng)。 首先我們嘗試用信號(hào)肽置換提高人凝血因子FVⅡ(FVⅡ)的分泌表達(dá)效率。FVII在內(nèi)、外源性止血途徑中起著重要作用,在臨床應(yīng)用具有極大的價(jià)值。而人FVII分泌表達(dá)效率很低,雖然FVII的研究已經(jīng)持續(xù)了幾十年,卻一直沒(méi)有明顯提高FVII的表達(dá)量。本研究嘗試用小鼠抗體Kappa輕鏈信號(hào)肽(IgK)、人干擾素IFN-α信號(hào)肽(IFN-α)、人干擾素IFN-γ信號(hào)肽(IFN-γ)、小鼠骨形成蛋白BMP6信號(hào)肽(BMP6)、小鼠組織纖溶酶原激活物tPA信號(hào)肽(tPA)置換信號(hào)肽,構(gòu)建FVII重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-信號(hào)肽-FVⅡ載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,使用Western Blot技術(shù)檢測(cè)上清中的FVⅡ蛋白和293T細(xì)胞內(nèi)的GFP蛋白,并使用軟件ImageJ對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析,從而比較FVⅡ的分泌表達(dá)效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠抗體Kappa輕鏈信號(hào)肽(IgK)和小鼠骨形成蛋白BMP6信號(hào)肽(BMP6)引導(dǎo)FVⅡ分泌表達(dá)效率比FVⅡ本身信號(hào)肽的要高3倍。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是基因工程產(chǎn)品下游生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié),在生產(chǎn)科研中發(fā)揮重要作用,而培養(yǎng)基是其中的關(guān)鍵。通常細(xì)胞的生長(zhǎng)與增值需要血清含有的各種因子的調(diào)節(jié)。但是血清批間存在質(zhì)量差異并可能存在支原體污染,特別是血清組分復(fù)雜非常不利于重組蛋白的下游純化等缺點(diǎn)。目前基于細(xì)胞及產(chǎn)品特性的無(wú)血清培養(yǎng)基的研制已經(jīng)成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要研究課題。本研究用293A細(xì)胞擴(kuò)增對(duì)照腺病毒Ad-GFP,使用氯化銫密度梯度離心法純化Ad-GFP并測(cè)定滴度；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(CHO細(xì)胞、L02細(xì)胞、PC3細(xì)胞)于血清培養(yǎng)條件達(dá)到95%的匯合度后,分別換用無(wú)血清培養(yǎng)基(高糖DMEM、RMPI1640、293Serum-Free Style),同時(shí)保留完全培養(yǎng)基維持的細(xì)胞感染作為對(duì)照,并使用不同的病毒感染復(fù)數(shù)去感染細(xì)胞,在感染后24h、48h、72h觀察GFP蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)于CHO細(xì)胞、L02細(xì)胞和PC3細(xì)胞,使用高糖DMEM維持的GFP蛋白表達(dá)亮度與完全培養(yǎng)基維持的GFP蛋白表達(dá)亮度沒(méi)有明顯差異,提示使用高糖DMEM維持腺病毒感染的動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白是一種可選策略。
【關(guān)鍵詞】：分泌表達(dá) 無(wú)血清 外源蛋白 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 重組腺病毒
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 前言14-17
• 第一部分 信號(hào)肽置換提高人凝血因子FVII的分泌表達(dá)17-38
• 1 材料17-20
• 1.1 試劑17
• 1.2 質(zhì)粒、感受態(tài)及細(xì)胞17
• 1.3 主要儀器17-18
• 1.4 主要試劑配制18-19
• 1.5 引物19-20
• 2 方法20-31
• 2.1 引物設(shè)計(jì)及合成20
• 2.2 基因片段的制備20-26
• 2.3 感受態(tài)DH5a的制備26-27
• 2.4 連接與轉(zhuǎn)化27-28
• 2.5 重組載體陽(yáng)性克隆的篩選28-29
• 2.6 重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染29-30
• 2.7 分泌表達(dá)的檢測(cè)30-31
• 2.8 分泌表達(dá)效率分析31
• 3 結(jié)果31-35
• 3.1 pAdTrack-CMV-信號(hào)肽-FVII成熟肽重組載體的構(gòu)建31-32
• 3.2 pAdTrack-CMV-FVII完全肽重組載體的構(gòu)建32-33
• 3.3 pAdTrack-CMV-信號(hào)肽-FVII轉(zhuǎn)染效率33-34
• 3.4 不同信號(hào)肽引導(dǎo)FVII分泌表達(dá)的差異34-35
• 4 討論35-37
• 5 小結(jié)37-38
• 第二部分 無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)外源基因在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的影響38-51
• 1 材料38-41
• 1.1 主要拭劑38
• 1.2 細(xì)胞、病毒和質(zhì)粒38
• 1.3 主要儀器38-39
• 1.4 主要試劑配制39-41
• 2 方法41-44
• 2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代培養(yǎng)41
• 2.2 重組腺病毒Ad-GFP的擴(kuò)增、純化41-43
• 2.3 使用綠色熒光標(biāo)記法測(cè)定重組腺病毒Ad-GFP的滴度43
• 2.4 CHO細(xì)胞、L02細(xì)胞、PC3細(xì)胞的接種鋪板及換液接毒43-44
• 2.5 綠色熒光觀察44
• 3 結(jié)果44-48
• 3.1 擴(kuò)增重組腺病毒Ad-GFP44-45
• 3.2 重組腺病毒Ad-GFP的純化及滴度測(cè)定45
• 3.3 觀察綠色熒光并判斷無(wú)血清培養(yǎng)對(duì)蛋白表達(dá)的影響45-48
• 4 討論48-50
• 5 小結(jié)50-51
• 總結(jié)51-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 縮略詞59-60
• 碩士期間發(fā)表論文情況60-61
• 致謝61-62

【參考文獻(xiàn)】

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