本文關鍵詞：大腦皮層Ast培養(yǎng)及CNTF對Ast的激活作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：本研究通過原代分離培養(yǎng)Ast，純化傳代獲得高純度的Ast，并進行檢測鑒定；通過應用CNTF作用于傳代培養(yǎng)的Ast，探討CNTF對Ast的激活作用，探索激活的最佳狀態(tài)，為探討癲癇發(fā)病機制提供新思路。 方法：(1)取新生24h內的SD大鼠，分離獲取大腦皮層，用手術刀片將其切成0.5~1mm3的碎塊狀，0.25%胰蛋白酶消化15min后，用含血清培養(yǎng)基終止消化，制備成單細胞懸液。經(jīng)細胞計數(shù)和差速貼壁后，將其以5×105/ml的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，DMEM-F12培養(yǎng)基原代培養(yǎng)(37oC，5%CO2)7~10d。待細胞長滿瓶底，置于恒溫搖床(240rpm,37oC)純化18h后，立即吸棄懸液，清洗2~3次，消化并收集細胞進行傳代培養(yǎng)。常規(guī)傳代3次后，采用免疫熒光雙標法檢測Ast的純度。 (2)應用手術刀片切碎法和剪刀剪碎法分別對大腦皮層組織進行切碎處理(其它任何條件相同)，并制備成單細胞懸液，于細胞計數(shù)儀上對細胞進行計數(shù)，每次分別應用兩種方法隨機計數(shù)10次，重復該方法操作3次，結果進行統(tǒng)計分析。 (3) CNTF對Ast的激活作用：隨機將培養(yǎng)的細胞分為實驗組和對照組，實驗組應用CNTF激活Ast后，采用SABC法結合DAB顯色，分別于12h、24h、36h、48h行GFAP免疫細胞化學染色；對照組為相同條件下未作任何處理的Ast；顯微鏡下觀察各組各個時間點細胞著色深淺變化情況，并計算陽性細胞百分比。最后進行統(tǒng)計學分析。 結果：(1)用手術刀片切碎法和剪刀剪碎法制備獲取懸液中單細胞數(shù)量，兩法比較采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。手術刀片切碎法結果為14.611.84，剪刀剪碎法結果為5.382.01，兩組比較P0.001，差別有統(tǒng)計學意義，可以認為手術刀片切碎法獲取的懸液中單細胞個數(shù)明顯偏多。 (2)經(jīng)原代分離培養(yǎng)及純化傳代后的細胞，行GFAP免疫熒光雙標檢測鑒定，結果顯示幾乎所有細胞皆為GFAP陽性細胞，Ast檢測純度為99.890.04%，表明培養(yǎng)的細胞可以用于后續(xù)實驗。 (3) CNTF對Ast的激活作用：1)根據(jù)GFAP陽性細胞著色強度判定：對照組著色均為淡黃色(+)；實驗組中，12h、36h、48h組著色為棕黃色(++)，24h組為棕褐色(+++)，著色強度隨時間總體變化趨勢為：著色由淺至深再至淺，其中24h組著色最深。 2)根據(jù)陽性細胞百分比判定：從時間效應看，12h、24h、36h、48h GFAP陽性表達率隨時間總體變化趨勢：對照組中無明顯變化趨勢；在實驗組中GFAP陽性表達率先增高后降低，于24h時GFAP陽性表達率最高。統(tǒng)計學分析：實驗組和對照組相同時間點間比較采用F檢驗，結果P值均0.001，差異有統(tǒng)計學意義；對照組中，不同時間點間比較采用F檢驗，，組間兩兩比較采用q檢驗，結果P值均0.05，差異均無統(tǒng)計學意義；實驗組中，不同時間點間比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，結果P值均0.01，差異均有統(tǒng)計學意義。 3)積分綜合計量分析結果：對照組為弱陽性(+)，12h、36h、48h組為陽性(++)，24h組為強陽性(+++)。研究結果表明：采用CNTF激活Ast后，于24h時呈現(xiàn)最佳激活狀態(tài)。 結論：(1)在原代單細胞懸液的制備中，手術刀片切碎法與剪刀剪碎法相比，前者可以顯著提高懸液中單細胞數(shù)量。 (2)應用原代分離培養(yǎng)、純化傳代的方法可獲得高純度的Ast。 (3) CNTF可激活Ast并顯著上調Ast的特異性標志物GFAP表達，CNTF激活Ast后，可能于24h時呈現(xiàn)最佳激活狀態(tài)。
【關鍵詞】：Ast 培養(yǎng) CNTF 激活作用
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 引言10-12
• 材料與方法12-18
• 結果18-25
• 討論25-31
• 結論31-32
• 參考文獻32-41
• 致謝41-42
• 附錄 A. 縮略詞對照表42-43
• 附錄 B. 主要試劑配制方法43-45
• 附錄 C. 個人簡歷45-46
• 附錄 D. 綜述46-55
• 參考文獻51-55

【參考文獻】

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本文編號：365743