本文關(guān)鍵詞：脂筏在fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性化過程中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear nertrophils)是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。中性粒細(xì)胞在宿主抵抗細(xì)菌和真菌感染中起著重要的作用,他們的主要功能是在機(jī)體發(fā)生炎癥時(shí),通過外滲出血管壁并遷移到炎癥位置,通過吞噬作用和釋放超氧化物和/或蛋白水解酶殺死細(xì)菌和入侵的微生物。一旦感知到趨化物質(zhì)的存在,中性粒細(xì)胞前極形成一個(gè)富含絲狀肌動(dòng)蛋白的片狀偽足,后極形成富含肌球蛋白的尾足。雖然中性粒細(xì)胞在生理功能中發(fā)揮重要作用,但如果遷移和外滲的機(jī)制和任何信號分子調(diào)控失敗,都會(huì)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的異常激活。臨床上一些疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、敗血癥、缺血/再灌注損傷、病毒性心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化、過敏反應(yīng)、炎癥性皮膚病甚至腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都和中性粒細(xì)胞極性功能有關(guān)。因而研究中性粒細(xì)胞極性機(jī)制,對防止中性粒細(xì)胞異常激活導(dǎo)致的各種疾病和組織損傷具有重要意義。 在極性研究的過程中,脂筏作為信號分子組織者是近些年的研究熱點(diǎn)。脂筏就像一個(gè)蛋白質(zhì)分子�？康钠脚_(tái),在受到外源趨化物的誘導(dǎo)下,它組裝大量的信號分子,與膜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)分選等保持高度密切的關(guān)系。脂筏上的膽固醇能夠被甲基-β-環(huán)糊精(Methyl-β-cyclodextrin, mpCD)包裹,從而破壞脂筏的結(jié)構(gòu)。在研究中使用mβCD包裹膽固醇后破壞脂筏結(jié)構(gòu)完整性,抑制了細(xì)胞的皺褶形成,使用CLM可以可逆性修復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)的完整性,這表明脂筏在中性粒細(xì)胞極性化過程中有著很重要的作用。 近年來,細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度(cytosolic free Ca2+concentration, Ca2+)變化被認(rèn)為參與中性粒細(xì)胞多種功能調(diào)節(jié),如極性(趨化)和遷移、活性氧的產(chǎn)生。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高依賴于兩種途徑：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放和細(xì)胞膜外鈣內(nèi)流。胞外鈣內(nèi)流主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫清空引起質(zhì)膜上的鈣通道開放導(dǎo)致外鈣內(nèi)流,就是所謂的鈣庫操縱的鈣內(nèi)流機(jī)制(store-operated Ca2+entry,SOCE).脂筏作為SOCE的信號平臺(tái)對于中性粒細(xì)胞極性化有著重要的作用,因而探討中性粒細(xì)胞極性化過程中膜電流的特性就顯得尤其重要,可以為研究中性粒細(xì)胞極性化提供電生理理論依據(jù)。 另有研究表明Rho小G蛋白參與極性形成、細(xì)胞的遷移、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等。尤其是Racl,Rac2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架而參與細(xì)胞極性和趨化的調(diào)節(jié)機(jī)制已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道過。Rho家族小G蛋白在中性粒細(xì)胞中參與細(xì)胞骨架重組,這些蛋白通過失活(GDP-bound)和激活(GTP-bound)兩種狀態(tài)的循環(huán)來控制一些生理過程,他們的活性是由鳥嘌呤核苷分解抑制因子(guanosine dissociation inhibitors), GTPase活化蛋白(GTPase activating proteins)和鳥嘌呤核苷交換因子(guanosine exchange factors,GEF)來調(diào)節(jié)。 因此,深入闡明脂筏在fMLP所誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性化的影響過程中的作用,為防止和治療中性粒細(xì)胞異常激活提供新的方向。 目的 本實(shí)驗(yàn)通過研究脂筏對fMLP所誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性的影響,探討脂筏在人中性粒細(xì)胞極性中的調(diào)控機(jī)制。 方法 1.采用Dextran方法讓紅細(xì)胞自然沉降,運(yùn)用經(jīng)典密度梯度離心,低滲裂解紅細(xì)胞后急性分離人外周血中性粒細(xì)胞。獲得的中性粒細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色,分析細(xì)胞活性,細(xì)胞的活度大于98%。 2.用Zigmond chamber觀察中性粒細(xì)胞的極性化率。 3. Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測中性粒細(xì)胞的定向遷移能力的變化。 4.運(yùn)用膜片鉗相關(guān)儀器檢測電極電阻并對中性粒細(xì)胞進(jìn)行封接和破膜,記錄膜電容和各種處理因素膜電流的變化。 5.使用鈣離子敏感性指示劑Fluo-4/AM預(yù)處理細(xì)胞后,在激光共聚焦顯微鏡下監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)鈣離子的變化情況。 6.應(yīng)用GST-pull down and Western blotting方法檢測活性Rac1, Rac2蛋白的表達(dá)。 7.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示,數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件處理分析。三組及三組以上樣本均數(shù)比較滿足方差齊性用One-way ANOVA方差分析,組間兩兩比較采用LSD法；若方差不齊,采用welch檢驗(yàn),組間兩兩比較采用Dunnett's T3法。P0.05為存在顯著性差異。 結(jié)果 1. fMLP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生SOCE,并使膜電位增加。 2. mpCD和CLM均能引起中性粒細(xì)胞膜電流的變化,與對照組或／和fMLP組比較,電流密度變化均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。mpCD破壞脂筏結(jié)夠完整性后抑制了fMLP誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣內(nèi)流,CLM可逆性恢復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)后細(xì)胞外鈣內(nèi)流增加。 3. Zigmond chamber實(shí)驗(yàn)顯示mpCD破壞細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)完整性后極性化率下降,CLM可逆性恢復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)完整性后極性化率上升。 4. Transwell小室檢測中性粒細(xì)胞的遷移能力的變化實(shí)驗(yàn)中,mβCD破壞細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)完整性后定向遷移能力顯著性下降,CLM恢復(fù)細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)完整性后中性粒細(xì)胞定向遷移能力與mpCD組相比顯著性增加。 5.免疫印跡結(jié)果顯示fMLP刺激組顯示活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶最濃,當(dāng)脂筏結(jié)構(gòu)完整性用mpCD破壞后再進(jìn)行fMLP刺激,則細(xì)胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶都比fMLP刺激組弱。而用CLM恢復(fù)細(xì)胞脂筏結(jié)構(gòu)后則細(xì)胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1的蛋白條帶比mβCD組強(qiáng)但比fMLP刺激組弱。 結(jié)論 1. fMLP可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞膜電流發(fā)生改變,這種改變可能參與介導(dǎo)SOCE的變化。 2.破壞脂筏結(jié)構(gòu)完整性的藥物(mpCD)能降低fMLP誘導(dǎo)極性細(xì)胞的膜電流,可逆性恢復(fù)脂筏結(jié)構(gòu)完整性藥物(CLM)可部分恢復(fù)fMLP誘導(dǎo)極性細(xì)胞的膜電流。 3. mβCD通過打破脂筏結(jié)構(gòu)完整性進(jìn)而抑制SOCE, CLM則可以部分恢復(fù)SOCE。 4.mβCD可降低fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞極性化率和定向遷移力,CLM能部分恢復(fù)fMLP誘導(dǎo)細(xì)胞的極性化率和定向遷移力。 5.脂筏結(jié)構(gòu)完整性可上調(diào)極性信號分子Rac1和Rac2蛋白的活性水平,從而實(shí)現(xiàn)對中性粒細(xì)胞極性的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：脂筏 中性粒細(xì)胞 極性 SOCE 膜電位 定向遷移
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-18
• 材料和方法18-34
• 1. 材料18-24
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 3. 數(shù)據(jù)處理33-34
• 結(jié)果34-52
• 1. fMLP誘導(dǎo)人中性粒細(xì)胞的膜電流與SOCE34-37
• 2. 打破脂筏結(jié)構(gòu)完整性與可逆性修復(fù)對膜電流和SOCE的影響37-46
• 3. Zigmond chamber觀察不同處理因素下fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性化率的變化46-48
• 4. 脂筏在fMLP誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞定向遷移的影響48-50
• 5. 中性粒細(xì)胞內(nèi)活化的Rac2、Rac1蛋白的影響50-52
• 討論52-60
• 全文小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 英文縮略詞表69-71
• 碩士期間發(fā)表論文71-72
• 致謝72-73

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  本文關(guān)鍵詞：脂筏在fMLP誘導(dǎo)的人中性粒細(xì)胞極性化過程中作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：365462