本文關(guān)鍵詞：基于三鏈DNA分子開(kāi)關(guān)的Aptamer傳感方法構(gòu)建與應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：核酸適配體與目標(biāo)分子的結(jié)合能產(chǎn)生構(gòu)象變化，是構(gòu)建基于核酸適配體生物傳感器的核心�；谶@一點(diǎn)，應(yīng)用于生物傳感研究中的核酸適配體探針出現(xiàn)了很多的設(shè)計(jì)構(gòu)型，比如單鏈的核酸適配體探針、雙鏈雜交或分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的核酸適配體探針等，然而這些設(shè)計(jì)策略都有一定的缺陷。在沒(méi)有對(duì)核酸適配體進(jìn)行標(biāo)記的傳感應(yīng)用中，比如：無(wú)標(biāo)記的單鏈核酸適配體結(jié)合電化學(xué)阻抗的方法、靜電吸附陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的方法或嵌入指示劑的方法等，無(wú)標(biāo)記的核酸適配體探針雖然很好的保持了其親和力與特異性，并且有著快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，但是很難結(jié)合能夠獲得高靈敏度信號(hào)的方法，具有一定的局限性；而在有標(biāo)記的核酸適配體的生物傳感應(yīng)用中，其核酸適配體的特異性與親和力不僅受到了影響，而且大多為都為單一的“signal on”或“signal off”獲取信號(hào)的探針設(shè)計(jì)，在這樣的設(shè)計(jì)策略下，其信號(hào)理論值的最大值只能達(dá)到100%，其傳感器的靈敏度的提高受到了一定的限制。而三鏈DNA的構(gòu)型是以Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對(duì)原理，一條核苷酸鏈通過(guò)氫鍵作用插入到雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的大溝中，平行或反平行纏繞在一起形成。我們希望利用這種特殊的DNA構(gòu)型，構(gòu)建新的核酸適配體探針生物傳感方法，解決其上提到的一些問(wèn)題。 基于此，本論文以核酸適配體作為識(shí)別探針，利用三鏈DNA這種特殊構(gòu)型，構(gòu)建了兩種核酸適配體生物傳感方法來(lái)檢測(cè)生物分子。主要包括以下兩個(gè)方面的研究工作： 一、基于三鏈DNA分子開(kāi)關(guān)構(gòu)建核酸適配體電化學(xué)傳感平臺(tái) 本工作利用免標(biāo)記的核酸適配體作為識(shí)別探針，結(jié)合三鏈DNA構(gòu)型分子開(kāi)關(guān)，，構(gòu)建了一種方便、快速的、通用型電化學(xué)生物傳感平臺(tái)。該傳感平臺(tái)中的三鏈分子開(kāi)關(guān)（APT-THDNA）包含兩個(gè)部分：一部分是作為識(shí)別元件的核酸適配體探針（APT），它是一條兩端分別延長(zhǎng)的目標(biāo)物核酸適配體；另一部分是作為信號(hào)報(bào)告的探針（STP），該部分呈發(fā)卡型結(jié)構(gòu)，并在其3’與5’分別標(biāo)記上了有電活性的亞甲基藍(lán)（MB）分子和巰基。其中APT的兩端延長(zhǎng)部分可以與STP環(huán)部的堿基序列互補(bǔ)雜交，形成一個(gè)能特異性捕獲目標(biāo)物的三鏈分子開(kāi)關(guān)。當(dāng)APT-THDNA分子開(kāi)關(guān)修飾在電極上時(shí)，由于其剛性結(jié)構(gòu)信號(hào)微弱，處于“eT off”狀態(tài)，當(dāng)有目標(biāo)物存在后，目標(biāo)物與其核酸適配體結(jié)合，分子開(kāi)關(guān)被打開(kāi)，MB靠近電極，信號(hào)恢復(fù)，處于“eT on”狀態(tài)，以此信號(hào)差異檢測(cè)目標(biāo)物。我們選擇人類α-凝血酶（Tmb）作為一種模式目標(biāo)物被用來(lái)證明該傳感平臺(tái)的可行性，且檢測(cè)限為4.5nM；此外，為了證明該傳感平臺(tái)的普遍性，我們通過(guò)替換Tmb的核酸適配體序列為三磷酸腺苷（ATP）的核酸適配體序列后，再進(jìn)行了同樣的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，且檢測(cè)限為60nM。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該傳感平臺(tái)不僅具有選擇性，而且也具有普遍性。 二、基于三鏈DNA分子開(kāi)關(guān)構(gòu)建雙信號(hào)核酸適配體熒光傳感方法檢測(cè)ATP 利用核酸適配體構(gòu)建了一種由目標(biāo)物誘導(dǎo)的三鏈DNA分子開(kāi)關(guān)控制實(shí)現(xiàn)雙信號(hào)“signal on”和“signal off”轉(zhuǎn)換的探針，發(fā)展了一種高靈敏而又簡(jiǎn)便的測(cè)定ATP的熒光傳感分析方法。該核酸適配體三鏈DNA熒光探針（ATFS）由三部分的探針構(gòu)成，分別是標(biāo)記有熒光基團(tuán)（FAM）的核酸適配體探針、標(biāo)記有四甲基羅丹明（TMA）的探針以及標(biāo)記有猝滅基團(tuán)BHQ-2的探針；且BHQ-2探針?lè)謩e與FAM探針和TMA探針雜交。沒(méi)有目標(biāo)物存在時(shí)，由于FAM與BHQ-2靠近，熒光被部分猝滅，而TMA的熒光不受影響。當(dāng)有ATP存在后，由于核酸適配體與目標(biāo)物的識(shí)別作用，F(xiàn)AM將遠(yuǎn)離猝滅基團(tuán)BHQ-2，從而熒光恢復(fù)；與此同時(shí)之前沒(méi)有被猝滅的TMA探針將會(huì)與暴露出來(lái)的BHQ-2探針上的堿基序列雜交形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)的分子開(kāi)關(guān)，使得TMA靠近BHQ-2，熒光因被猝滅而減弱。我們以這兩種熒光信號(hào)前后的變化總值為響應(yīng)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了更靈敏地檢測(cè)目標(biāo)物ATP的目的，檢測(cè)限低至1nM。若稍作序列的修改，該方法還能用于其他目標(biāo)物的檢測(cè)。該熒光檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、選擇性好，且在不需要任何的放大策略的前提下提高了檢測(cè)的信號(hào)。
【關(guān)鍵詞】：核酸適配體 電化學(xué)傳感平臺(tái) 熒光傳感分析 三鏈DNA分子開(kāi)關(guān) 人類α-凝血酶 三磷酸腺苷
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文常用英文縮略詞表11-12
• 第1章 緒論12-31
• 1.1 引言12-13
• 1.2 核酸適配體13-15
• 1.2.1 核酸適配體的概述簡(jiǎn)介13
• 1.2.2 核酸適配體的優(yōu)勢(shì)13-14
• 1.2.3 核酸適配體的空間結(jié)構(gòu)14-15
• 1.3 核酸適體在生物傳感分析中的應(yīng)用15-25
• 1.3.1 生物傳感器的概述15
• 1.3.2 核酸適配體在電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用15-20
• 1.3.3 核酸適配體在熒光生物傳感器中的應(yīng)用20-25
• 1.4 三鏈 DNA25-29
• 1.4.1 三鏈 DNA 的結(jié)構(gòu)25-27
• 1.4.2 影響三鏈 DNA 穩(wěn)定性的因素27
• 1.4.3 三鏈 DNA 的分類27-29
• 1.5 本文擬開(kāi)展的工作29-31
• 第2章 基于三鏈 DNA 分子開(kāi)關(guān)構(gòu)建核酸適配體電化學(xué)傳感平臺(tái)31-46
• 2.1 前言31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分32-35
• 2.2.1 試劑和儀器32-33
• 2.2.2 APT-THDNA 分子開(kāi)關(guān)的形成33
• 2.2.3 金電極的預(yù)處理33-34
• 2.2.4 工作電極的修飾34
• 2.2.5 電化學(xué)檢測(cè) Tmb34
• 2.2.6 電化學(xué)檢測(cè) ATP34
• 2.2.7 通用傳感平臺(tái)的重復(fù)使用34-35
• 2.3 結(jié)果與討論35-45
• 2.3.1 檢測(cè)原理35-36
• 2.3.3 電極修飾的表征36
• 2.3.4 實(shí)驗(yàn)可行性的考察36-37
• 2.3.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化37-40
• 2.3.6 Tmb 的電化學(xué)檢測(cè)40-41
• 2.3.7 ATP 的電化學(xué)檢測(cè)41-43
• 2.3.8 選擇性實(shí)驗(yàn)43
• 2.3.9 通用傳感平臺(tái)重復(fù)使用考察43-45
• 2.4 小結(jié)45-46
• 第3章 基于三鏈 DNA 分子開(kāi)關(guān)構(gòu)建雙信號(hào)核酸適配體熒光傳感方法檢測(cè) ATP46-57
• 3.1 前言46-47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分47-49
• 3.2.1 主要儀器和試劑47-48
• 3.2.2 熒光分子探針 ATFS 的形成48
• 3.2.3 熒光掃描48
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)可行性48-49
• 3.3 結(jié)果與討論49-56
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理49-50
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)可行性的考察50-51
• 3.3.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化51-54
• 3.3.4 目標(biāo)物 ATP 的熒光檢測(cè)54-55
• 3.3.5 選擇性實(shí)驗(yàn)55-56
• 3.4 小結(jié)56-57
• 結(jié)論57-58
• 文獻(xiàn)引用58-64
• 致謝64-65
• 附錄A 攻讀碩士學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

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6 袁若;;電化學(xué)蛋白質(zhì)生物傳感器的研究[J];化學(xué)傳感器;2011年04期

7 孟慶玲;陳創(chuàng)夫;;SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J];塔里木大學(xué)學(xué)報(bào);2008年03期

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本文編號(hào)：364478