本文關(guān)鍵詞：機械應(yīng)力刺激對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及細胞內(nèi)Pannexin1表達和ATP釋放的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：探索應(yīng)力刺激對細胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性的影響，檢測應(yīng)力刺激下細胞內(nèi)I型膠原蛋白表達的變化，觀察應(yīng)力刺激下細胞內(nèi)pannexin1通道蛋白的表達及分布變化，檢測在應(yīng)力刺激下細胞釋放ATP的變化。 方法：實驗于2011.8-2012.12在大連醫(yī)科大學(xué)中心實驗室完成。 1.取3周齡SD大鼠雌雄不限100-120克,使大鼠雙側(cè)股骨及脛骨全長充分暴露，抽取全骨髓細胞，用全骨髓培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)。 2.紫外分光光度計法：將細胞分為施加應(yīng)力刺激和不施加應(yīng)力刺激兩組，施加應(yīng)力刺激組刺激時間為15分鐘，4000μstrain。兩組同時將細胞消化并將細胞進行計數(shù)，調(diào)整兩組細胞數(shù)一致，利用超生破碎（工作15s，停30s，3-4次）提取蛋白，4℃低溫離心（12000rpm，10min）取上清，用紫外分光光度計測定堿性磷酸酶（ALP）活性的差異。 3.細胞免疫化學(xué)染色法：通過對細胞進行應(yīng)力刺激干預(yù)分為兩組，施加應(yīng)力組和不加應(yīng)力組。用4％多聚甲醛將細胞固定20min，，檸檬酸鹽緩沖液對細胞進行抗原修復(fù)10min，用0.1％Triton將細胞破膜15min，敷一抗過夜，二抗結(jié)合1h，DAB顯色10min，利用顯微鏡觀察細胞內(nèi)I型膠原蛋白表達情況。 4.用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標記pannexin1通道蛋白的表達和分布。 5.熒光素酶法：實驗分為空白組，施加應(yīng)力刺激組，不加應(yīng)力刺激組。利用ATP生物熒光試劑盒檢測細胞釋放ATP的變化。 6.統(tǒng)計學(xué)方法：統(tǒng)計數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行分析，各組間比較采用進行單因素方差分析，概率P0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，P0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：1.利用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞24h后貼壁良好，48h后細胞覆蓋率約達70％-80％，繼續(xù)培養(yǎng)細胞增值迅速，傳代穩(wěn)定。 2.通過紫外分光光度計法測定細胞內(nèi)堿性磷酸酶（ALP）活性，測定結(jié)果顯示施加應(yīng)力刺激組堿性磷酸酶活性增強。 3.利用細胞免疫化學(xué)染色法檢測細胞內(nèi)I型膠原蛋白的表達，經(jīng)過施加應(yīng)力刺激組細胞內(nèi)I型膠原蛋白的表達量增加。 4.通過熒光顯微鏡觀察到免疫熒光標記pannexin1通道蛋白的表達及分布的變化。 5.利用ATP生物熒光試劑盒檢測到施加應(yīng)力刺激組細胞釋放ATP的量顯著增多。 結(jié)論：1.施加應(yīng)力刺激使細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性增強，I型膠原蛋白表達量增加，從而促進細胞的成骨分化。2.施加應(yīng)力刺激細胞內(nèi)免疫熒光標記pannexin1通道蛋白的表達增強。3.施加應(yīng)力刺激促進細胞ATP的釋放。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細胞 機械應(yīng)力刺激 成骨分化 pannexin1 ATP
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-12
• 材料和方法12-19
• 1．實驗材料12-14
• 1.1 細胞來源12
• 1.2 主要試劑12
• 1.3 實驗所用主要抗體12
• 1.4 主要儀器和耗材12-13
• 1.5 主要試劑的配制13-14
• 2.實驗方法14-19
• 2.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)14-15
• 2.2 實驗細胞分組及四點彎曲細胞應(yīng)力加載儀15-17
• 2.3 紫外分光光度計法檢測堿性磷酸酶活性17
• 2.4 細胞免疫化學(xué)染色法觀察 I 型膠原蛋白的表達17-18
• 2.5 細胞免疫熒光染色法利用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標記pannexin1 通道蛋白的表達和分布18-19
• 2.6 熒光素酶法利用 ATP 生物熒光試劑盒檢測細胞釋放 ATP 的變化19
• 結(jié)果19-25
• 討論25-28
• 結(jié)論28-29
• 參考文獻29-32
• 綜述32-41
• 參考文獻37-41
• 附錄41-42
• 致謝42-43

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 江凌勇;趙志河;王軍;樊瑜波;;張應(yīng)力對成骨分化骨髓間充質(zhì)干細胞ODF mRNA表達的影響[J];醫(yī)用生物力學(xué);2010年06期

  本文關(guān)鍵詞：機械應(yīng)力刺激對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及細胞內(nèi)Pannexin1表達和ATP釋放的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：364382