本文關鍵詞：慢病毒載體介導的IDO基因在人臍帶間充質干細胞表達的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：1，從人的臍帶組織中分離和培養(yǎng)臍帶間充質干細胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUC-MSCs），并對hUC-MSCs的生物學特性進行研究； 2，構建共同表達人IDO基因和增強型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）基因的慢病毒表達載體，并進行慢病毒顆粒的包裝，純化，濃縮及滴度測定； 3，以EGFP作為報告基因，篩選慢病毒轉染hUC-MSCs最佳MOI值；研究攜帶重組IDO基因慢病毒顆粒轉染hUC-MSCs后，基因及蛋白表達的情況，并對轉染后的hUC-MSCs的生物學特性進行探討。為進一步利用基因修飾的間充質干細胞對再障小鼠模型的治療打下基礎，為再生障礙性貧血的治療尋找新的途徑。 方法：1，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞，培養(yǎng)2周后得到貼壁細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，細胞計數(shù)繪制細胞生長曲線；應用流式細胞儀鑒定細胞表面標志；化學染色檢測體外誘導成脂和成骨分化的能力； 2，設計相應引物，從含有人IDO基因的cDNA文庫中，利用PCR方法釣取人IDO基因的全長編碼區(qū)片段。將目的因與經酶切線性化的慢病毒表達載體GV218-EGFP進行定向的連接，將產物轉化細菌感受態(tài)細胞。對長出的克隆進行菌落PCR鑒定并對陽性的克隆進行測序及比對分析。重組慢病毒表達載體質粒及輔助包裝質粒共轉染293T細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況；實時熒光定量PCR檢測慢病毒濃縮液的滴度。 3，取足月兒臍帶以組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hUCMSCs，以不同的感染復數(shù)（multipleofinfection，MOI，分別為0、10、20、30、50、100）的重組慢病毒感染hUC-MSCs，通過報告基因EGFP的表達篩選最佳MOI；用IDO重組慢病毒以最佳MOI值感染hUC-MSCs作為實驗組，以空載體轉染的hUC-MSCs（空載體組）及未轉染的hUC-MSCs（空白組）作為對照，應用RT-PCR及Westernblot法分別檢測細胞中IDOmRNA及IDO蛋白水平的表達情況。 結果：1，，體外培養(yǎng)8-10d左右，細胞從組織塊中爬出；細胞傳代培養(yǎng)至第10代，無明顯形態(tài)及增增殖能力改變；細胞陽性表達CD44，CD73，而CD34表達陰性。體外誘導實驗證實，hUC-MSCs具有成脂及成骨分化的能力。 2，經PCR及基因測序鑒定GV218-EGFP-IDO重組慢病毒表達載體構建成功，包裝慢病毒Lentivirus-IDO滴度為2×108TU/mL。 3，分別以不同MOI值的重組慢病毒感染hUCMSCs后，通過EGFP表達的陽性細胞數(shù)篩選其最適MOI為30，此時對細胞的轉染效率可達到80%以上。RT-PCR檢測顯示實驗組IDOmRNA表達陽性，空載體組和未轉染組均為陰性；Westernblot檢測示實驗組細胞內IDO蛋白表達陽性，空載體組和未轉染組均為陰性。 結論：1,體外成功分離與培養(yǎng)了hUC-MSCs，具有間充質干細胞生物學特性； 2,成功構建并包裝出高滴度的人IDO基因重組慢病毒載體； 3，篩選出最佳MOI值為30，攜帶重組人IDO基因慢病毒顆粒感染hUC-MSCs后，其在基因及蛋白水平均陽性表達IDO。
【關鍵詞】：IDO基因 綠色熒光蛋白 轉染 慢病毒表達載體 臍帶間充質干細胞
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R556.5;R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第一部分 人臍帶間充質干細胞的分離培養(yǎng)及其生物學特性研究11-20
• 引言11-12
• 主要材料與儀器12-13
• 實驗方法13-15
• 實驗結果15-18
• 討論18-20
• 第二部分 重組表達人 IDO 基因慢病毒載體的構建及鑒定20-35
• 引言20-21
• 主要材料與儀器21-22
• 實驗方法22-29
• 實驗結果29-33
• 討論33-35
• 第三部分 慢病毒介導的 IDO 基因穩(wěn)定轉染 hUC- MSCs 及功能的測定35-51
• 引言35
• 主要材料與儀器35-37
• 實驗方法37-45
• 實驗結果45-49
• 討論49-51
• 結論51-52
• 參考文獻52-57
• 致謝57-58
• 附錄 A 中英文術語縮略語對照表58-59
• 附錄 B 主要試劑配制59-61
• 附錄 C 個人簡介及攻讀學位期間公開發(fā)表的論文61-62
• 附錄 D 綜述 慢病毒載體的研究進展62-69
• 參考文獻67-69

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前10條

1 魏林;邱飛;刁勇;;病毒載體的高分子修飾研究進展[J];病毒學報;2011年04期

2 扎拉嘎胡;買霞;陳曉;陳小義;陳莉;;人臍血間充質干細胞培養(yǎng)及其生物學特性的研究[J];解剖科學進展;2009年02期

3 孫麗;于麗;張華芳;江洪;;人臍帶間充質干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性[J];解剖科學進展;2011年02期

4 王躍春;張洹;;人胚胎骨髓間充質干細胞的增殖能力及其向三個胚層起源細胞分化的特性[J];生理學報;2008年03期

5 康鵬云;周鑫磊;張宇晶;平超強;李亮;洪珞珈;;臍帶間充質干細胞與再生障礙性貧血[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2012年10期

6 李躍萍;宋麗萍;邱曙東;;慢病毒載體在腫瘤基因治療中的應用[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學;2006年12期

7 夏凌輝;江匯娟;方峻;劉芳;張純;宋善俊;;ALG/ATG為主的免疫抑制劑治療重型再生障礙性貧血的臨床研究[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2006年02期

8 董毅;朱太崗;夏瑞祥;李月紅;葛曦;曾慶曙;倪靜;李慶生;;骨髓間充質干細胞治療再生障礙性貧血模型鼠的機制[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年36期

9 黃益民;張穎;辛毅;胡著濤;羅毅;;小鼠活體內hMSCs干細胞生物發(fā)光示蹤監(jiān)測[J];心肺血管病雜志;2010年04期

10 喬艷;趙春亭;劉竹珍;馮獻啟;王麗;劉世海;;人同源盒基因HOXB4慢病毒載體的構建及其在人臍帶間充質干細胞中的表達(英文)[J];中國實驗血液學雜志;2012年03期

  本文關鍵詞：慢病毒載體介導的IDO基因在人臍帶間充質干細胞表達的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：363830