本文關(guān)鍵詞：慢病毒載體介導(dǎo)的IDO基因在人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：1，從人的臍帶組織中分離和培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUC-MSCs），并對(duì)hUC-MSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行研究； 2，構(gòu)建共同表達(dá)人IDO基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）基因的慢病毒表達(dá)載體，并進(jìn)行慢病毒顆粒的包裝，純化，濃縮及滴度測(cè)定； 3，以EGFP作為報(bào)告基因，篩選慢病毒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs最佳MOI值；研究攜帶重組IDO基因慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染hUC-MSCs后，基因及蛋白表達(dá)的情況，并對(duì)轉(zhuǎn)染后的hUC-MSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行探討。為進(jìn)一步利用基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)再障小鼠模型的治療打下基礎(chǔ)，為再生障礙性貧血的治療尋找新的途徑。 方法：1，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)2周后得到貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志；化學(xué)染色檢測(cè)體外誘導(dǎo)成脂和成骨分化的能力； 2，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，從含有人IDO基因的cDNA文庫(kù)中，利用PCR方法釣取人IDO基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)片段。將目的因與經(jīng)酶切線性化的慢病毒表達(dá)載體GV218-EGFP進(jìn)行定向的連接，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并對(duì)陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序及比對(duì)分析。重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒及輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)慢病毒濃縮液的滴度。 3，取足月兒臍帶以組織塊貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hUCMSCs，以不同的感染復(fù)數(shù)（multipleofinfection，MOI，分別為0、10、20、30、50、100）的重組慢病毒感染hUC-MSCs，通過(guò)報(bào)告基因EGFP的表達(dá)篩選最佳MOI；用IDO重組慢病毒以最佳MOI值感染hUC-MSCs作為實(shí)驗(yàn)組，以空載體轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs（空載體組）及未轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs（空白組）作為對(duì)照，應(yīng)用RT-PCR及Westernblot法分別檢測(cè)細(xì)胞中IDOmRNA及IDO蛋白水平的表達(dá)情況。 結(jié)果：1，，體外培養(yǎng)8-10d左右，細(xì)胞從組織塊中爬出；細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第10代，無(wú)明顯形態(tài)及增增殖能力改變；細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD44，CD73，而CD34表達(dá)陰性。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hUC-MSCs具有成脂及成骨分化的能力。 2，經(jīng)PCR及基因測(cè)序鑒定GV218-EGFP-IDO重組慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，包裝慢病毒Lentivirus-IDO滴度為2×108TU/mL。 3，分別以不同MOI值的重組慢病毒感染hUCMSCs后，通過(guò)EGFP表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)篩選其最適MOI為30，此時(shí)對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到80%以上。RT-PCR檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組IDOmRNA表達(dá)陽(yáng)性，空載體組和未轉(zhuǎn)染組均為陰性；Westernblot檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)IDO蛋白表達(dá)陽(yáng)性，空載體組和未轉(zhuǎn)染組均為陰性。 結(jié)論：1,體外成功分離與培養(yǎng)了hUC-MSCs，具有間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性； 2,成功構(gòu)建并包裝出高滴度的人IDO基因重組慢病毒載體； 3，篩選出最佳MOI值為30，攜帶重組人IDO基因慢病毒顆粒感染hUC-MSCs后，其在基因及蛋白水平均陽(yáng)性表達(dá)IDO。
【關(guān)鍵詞】：IDO基因 綠色熒光蛋白 轉(zhuǎn)染 慢病毒表達(dá)載體 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R556.5;R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第一部分 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性研究11-20
• 引言11-12
• 主要材料與儀器12-13
• 實(shí)驗(yàn)方法13-15
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果15-18
• 討論18-20
• 第二部分 重組表達(dá)人 IDO 基因慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定20-35
• 引言20-21
• 主要材料與儀器21-22
• 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-33
• 討論33-35
• 第三部分 慢病毒介導(dǎo)的 IDO 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 hUC- MSCs 及功能的測(cè)定35-51
• 引言35
• 主要材料與儀器35-37
• 實(shí)驗(yàn)方法37-45
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-49
• 討論49-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 致謝57-58
• 附錄 A 中英文術(shù)語(yǔ)縮略語(yǔ)對(duì)照表58-59
• 附錄 B 主要試劑配制59-61
• 附錄 C 個(gè)人簡(jiǎn)介及攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文61-62
• 附錄 D 綜述 慢病毒載體的研究進(jìn)展62-69
• 參考文獻(xiàn)67-69

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：363830