本文關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒16型全基因組克隆及其表達(dá)載體構(gòu)建，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的人乳頭瘤病毒(HPV)是一種小型無(wú)包膜、雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其分型依據(jù)是根據(jù)L1基因的序列相似性制定,L1基因的序列相似性90%為新的型別，相似性在90%~98%之間為同一型別的不同亞型，相似性98%為同一型別的不同變異株。全世界約70%的宮頸癌和高危型HPV16、18型直接相關(guān)，大約25%的口腔癌與高危型HPV有關(guān)，安徽省合肥地區(qū)宮頸癌發(fā)生率與感染HPV16具有較高的相關(guān)性。本研究通過(guò)克隆安徽省人乳頭狀瘤病毒16型(human papillomavirus type16, HPV16)全基因組，分析HPV16全基因組序列，并以全基因組序列信息為基礎(chǔ)構(gòu)建含HPV16全基因組的表達(dá)載體，為建立HPV16轉(zhuǎn)染體系打下基礎(chǔ)。 方法(1) HPV16全基因組克隆：收集5例安徽省宮頸癌病理組織標(biāo)本并提取總DNA，在GenBank中下載不同的HPV16全基因組序列并用DNAStar軟件進(jìn)行序列比對(duì)，將HPV16全基因組分成4個(gè)區(qū)段，即HPV-A、HPV-B、HPV-C和HPV-D，分別設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物，分段克隆HPV16全基因組，測(cè)序后進(jìn)行序列拼接及核苷酸序列分析。(2)構(gòu)建環(huán)化的HPV16全基因組：對(duì)含有HPV16的總DNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，回收1拷貝線性HPV16全基因組，再用連接酶使其自環(huán)化，BamHI位于片段HPV-A內(nèi)，PCR擴(kuò)增環(huán)化HPV16中的片段HPV-A，驗(yàn)證是否構(gòu)建成功。(3)構(gòu)建HPV16全基因組表達(dá)載體：同尾酶BamHI和BglII雙酶切表達(dá)載體pLEGFP-N1，1拷貝線性HPV16插入雙酶切后的載體pLEGFP-N1，命名pG/1H；擴(kuò)增HPV16基因組中6152-120bp的片段(相當(dāng)于0.2拷貝HPV16基因組)，改造載體pLEGFP-N1的酶切位點(diǎn)，將0.2拷貝HPV16插入質(zhì)粒pG/1H，命名pG/1.2H，測(cè)序驗(yàn)證PCR保真性，酶切驗(yàn)證構(gòu)建是否成功。 結(jié)果(1)檢測(cè)到1個(gè)宮頸癌病理樣本中含有HPV16并獲得全基因組序列，，序列全長(zhǎng)7906nts (GenBank登錄號(hào)：KC935953)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，安徽HPV16(HPV16-Anhui)與HPV16-TH和HPV16-JP的全基因組核苷酸序列相似性最高，達(dá)99.5%。系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)分析顯示，HPV16-Anhui與其他7個(gè)HPV16型聚成1個(gè)單獨(dú)的分支。(2)環(huán)化的HPV16DNA電泳速度與線性HPV16有明顯差異，從環(huán)化的HPV16中成功擴(kuò)增出片段HPV-A，說(shuō)明構(gòu)建成功。(3) BamHI和HindIII雙酶切pG/1.2H，得到14797bp (其中載體pLEGFP-N16891bp，1拷貝HPV167906bp)和1857bp (0.2拷貝HPV16)2個(gè)條帶，驗(yàn)證HPV16全基因組表達(dá)載體構(gòu)建成功。 結(jié)論(1)獲得安徽省首例HPV16全基因組核苷酸序列，HPV16-Anhui與不同地區(qū)HPV16親緣關(guān)系均較近且基因組變異性較小。本研究對(duì)進(jìn)一步了解安徽省甚至華東地區(qū)HPV16病毒基因組變異和進(jìn)化規(guī)律具有重要意義。(2)成功構(gòu)建含HPV16全基因組的表達(dá)載體和環(huán)化的HPV16全基因組，為HPV16完整基因組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的體系奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人乳頭狀瘤病毒16型 全基因組 克隆 序列分析 表達(dá)載體
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R373
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-14
• 材料和方法14-31
• 結(jié)果31-43
• 討論43-46
• 結(jié)論46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 附錄50-51
• 致謝51-52
• 綜述52-59
• 參考文獻(xiàn)56-59

【相似文獻(xiàn)】

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