本文關(guān)鍵詞：基于微流控芯片的細(xì)胞電融合誘導(dǎo)小鼠體細(xì)胞重編程的去甲基化機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：已分化的體細(xì)胞可以通過體細(xì)胞核移植、干細(xì)胞提取物共培養(yǎng)、特定因子誘導(dǎo)和細(xì)胞融合等方法重編程為多能干細(xì)胞，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。其中體細(xì)胞核移植技術(shù)難度大、成功率低，干細(xì)胞提取物共培養(yǎng)和特定因子誘導(dǎo)的方法也都存在耗時(shí)長、效率低下等缺點(diǎn)。相比之下，細(xì)胞融合誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程耗時(shí)最短，重編程效率也最高，但融合細(xì)胞為四倍體，限制了其臨床應(yīng)用，而更適合于用作體細(xì)胞重編程機(jī)制研究。細(xì)胞融合主要有化學(xué)方法(如聚乙二醇誘導(dǎo)融合法)、生物方法(如病毒誘導(dǎo)融合法)和物理方法(如電場誘導(dǎo)融合法)三種，這三種方法均已應(yīng)用于誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的研究。其中聚乙二醇在誘導(dǎo)細(xì)胞融合過程中，對細(xì)胞損傷較大、殘留細(xì)胞毒性且融合率較低，而病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合則存在病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價(jià)差異大、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差等缺點(diǎn)。電融合操作簡單、無化學(xué)毒性、對細(xì)胞損傷小、融合率也更高，已成為研究體細(xì)胞重編程的重要手段。 在重編程過程中，體細(xì)胞多能性基因的表觀遺傳學(xué)修飾是體細(xì)胞重編程的關(guān)鍵所在。這些表觀遺傳學(xué)的修飾包括：染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾和DNA的去甲基化，其中DNA去甲基化在體細(xì)胞重編程中尤為重要。雖然在哺乳動物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)明確的去甲基化酶，但已有研究證實(shí)AID(Activation-induced cytidine deaminase)和Tet(ten-eleven translocation)酶可能分別通過對核酸的脫氨酶作用和羥基化實(shí)現(xiàn)DNA的去甲基化。 目的：采用本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)并經(jīng)過改良的微流控電融合芯片，進(jìn)行小鼠成纖維細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)，通過流式細(xì)胞術(shù)篩選出融合細(xì)胞，研究融合細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性，證實(shí)融合細(xì)胞發(fā)生了體細(xì)胞重編程，并探討體細(xì)胞重編程的去甲基化機(jī)制。 方法及結(jié)果：本研究分為兩個(gè)部分 第一部分：細(xì)胞電融合及融合細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性研究 1、通過將非融合區(qū)用絕緣材料封閉，使電場集中在融合區(qū)，改良了微流控電融合芯片，構(gòu)建了高通量的細(xì)胞電融合平臺，通過此平臺將轉(zhuǎn)染了綠色熒光的mESCs與轉(zhuǎn)染了紅色熒光的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行電融合，其平均排隊(duì)率為44.35%，平均融合率為59.88%，實(shí)現(xiàn)了NIH3T3/RFP和mESCs/GFP的高效融合。 2、通過流式細(xì)胞儀篩選出同時(shí)表達(dá)綠色熒光和紅色熒光的融合細(xì)胞，在小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能夠形成類似于mESCs的克隆。qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NIH3T3細(xì)胞不表達(dá)多能性基因OCT4和Nanog，mESCs和融合細(xì)胞OCT4和Nanog基因mRNA水平較高，且兩者統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異。而融合細(xì)胞體細(xì)胞標(biāo)記性基因CKAP2和LaminA/C表達(dá)下調(diào)，與NIH3T3相比分別下降了89%和95%，且融合細(xì)胞和mESCs的CKAP2和LaminA/C基因mRNA水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明NIH3T3/RFP和mESCs/GFP融合后，融合細(xì)胞的多能性基因和體細(xì)胞標(biāo)記性基因表達(dá)水平均達(dá)到了與mESCs類似的水平，證實(shí)了融合細(xì)胞發(fā)生了體細(xì)胞重編程。 第二部分：基于微流控芯片的體細(xì)胞重編程去甲基化機(jī)制的研究 1、利用斑點(diǎn)雜交方法檢測細(xì)胞融合前后甲基化水平的變化，發(fā)現(xiàn)NIH3T3的5mC水平較高，幾乎不表達(dá)5hmC，而mESCs和融合細(xì)胞則5hmC水平較高，幾乎不表達(dá)5mC。通過BSP檢測，發(fā)現(xiàn)NIH3T3的OCT4和Nanog基因啟動子區(qū)的甲基化比例分別為64.38%和80%，mESCs的OCT4和Nanog基因啟動子區(qū)的甲基化比例則為0%和4%，細(xì)胞融合后融合細(xì)胞OCT4和Nanog基因啟動子區(qū)甲基化水平也分別降至16.88%和20%。再通過glucMS-qPCR方法檢測發(fā)現(xiàn)融合細(xì)胞在融合后24h、48h、72h和96h的OCT4基因啟動子區(qū)的甲基化比例分別為85.51%、64.06%、54%和28.04%，各時(shí)間點(diǎn)之間甲基化比例有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，，說明融合細(xì)胞逐步發(fā)生了去甲基化。 2、qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞融合后融合細(xì)胞的AID,Tet1,Tet2表達(dá)上調(diào)，分別是NIH3T3的2.9倍，10.5倍和14.4倍，是mESCs的2.1倍，2.2倍和2.3倍，三者之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Tet3表達(dá)下調(diào)，與NIH3T3相比下降了94%，與mESCs水平相似，融合細(xì)胞與mESCs兩者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而NIH3T3,mESCs和融合細(xì)胞的TDG和MBD4基因表達(dá)水平相似，三者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光檢測也發(fā)現(xiàn)了AID在融合細(xì)胞和mESCs表達(dá)較高，而在NIH3T3中幾乎不表達(dá)，提示Tet1,Tet2，AID,TDG和MBD4可能參與了融合細(xì)胞的去甲基化過程。 結(jié)論： 1、通過改良的微流控電融合芯片，構(gòu)建了高通量的細(xì)胞電融合平臺，可實(shí)現(xiàn)mESCs與NIH3T3的高效融合，使體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞。 2、細(xì)胞電融合能夠使體細(xì)胞多能性基因OCT4和Nanog啟動子區(qū)去甲基化，從而實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞重編程過程中關(guān)鍵的表觀遺傳學(xué)修飾。 3、細(xì)胞融合后AID、Tet1、Tet2基因表達(dá)上調(diào)，Tet3基因表達(dá)明顯下降，TDG和MBD4基因表達(dá)水平無明顯變化，提示AID、Tet1、Tet2、TDG和MBD4可能參與了細(xì)胞電融合過程中的DNA去甲基化過程。
【關(guān)鍵詞】：微流控芯片 電融合 體細(xì)胞重編程 DNA去甲基化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• Abstract7-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 第二章 細(xì)胞電融合及融合細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)特性研究16-32
• 2.1 微流控芯片的改良及 mESC-NIH3T3 細(xì)胞電融合16-23
• 2.1.1 材料與方法16-19
• 2.1.2 結(jié)果19-23
• 2.2 mESC-NIH3T3 融合細(xì)胞的篩選及細(xì)胞生物學(xué)鑒定23-29
• 2.2.1 材料與方法23-26
• 2.2.2 結(jié)果26-29
• 2.3 討論29-31
• 2.4 小結(jié)31-32
• 第三章 基于微流控芯片的體細(xì)胞重編程去甲基化機(jī)制的研究32-50
• 3.1 電融合誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的 DNA 去甲基化研究32-43
• 3.1.1 材料與方法32-39
• 3.1.2 結(jié)果39-43
• 3.2 Tet-AID 通路在電融合誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程中的作用機(jī)制研究43-47
• 3.2.1 材料與方法43-46
• 3.2.2 結(jié)果46-47
• 3.3 討論47-49
• 3.4 小結(jié)49-50
• 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 文獻(xiàn)綜述 細(xì)胞融合致體細(xì)胞重編程機(jī)制研究進(jìn)展57-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 研究生期間發(fā)表論文66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 夏斌;楊軍;胡寧;陰正勤;徐海偉;鄭小林;;基于MEMS細(xì)胞電融合芯片的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)研究[J];傳感器與微系統(tǒng);2009年02期

2 胡寧;楊軍;侯文生;鄭小林;曹毅;楊靜;許蓉;張瑞強(qiáng);;基于SOI基底的高通量細(xì)胞電融合芯片[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2009年01期

  本文關(guān)鍵詞：基于微流控芯片的細(xì)胞電融合誘導(dǎo)小鼠體細(xì)胞重編程的去甲基化機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：363149