本文關(guān)鍵詞：小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及促腎上腺皮質(zhì)激素的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 研究小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)成骨分化的機(jī)理及促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）對其成骨分化作用的影響。 方法 1.取小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）D1細(xì)胞系，作為研究對象。 2.實(shí)驗(yàn)分組： 第一部分：小鼠BMMSCs成骨分化-實(shí)驗(yàn)分組 第1組：對照組1：低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S）； 第2組：低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗壞血酸鈉（AscorbicAcid, AA10ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S）； 第3組：低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗壞血酸鈉（AscorbicAcid, AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S）； 第4組：低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S）； 第5組：低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗壞血酸鈉（AscorbicAcid, AA10ug/ml）+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S）; 第6組：低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗壞血酸鈉（AscorbicAcid, AA50ug/ml）+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S） 第7組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S） 第8組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid, AA10ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S） 第9組:低糖的細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid, AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S） 第10組:對照組2:標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(低糖細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗壞血酸鈉（AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S），BM組) 第11組:對照組2+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)，成骨OM組 第12組:對照組2+p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑 第13組:成骨OM組（β-gp10mM）+p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑 第14組:對照組2+JNK氨基末端蛋白激酶抑制劑 第15組:成骨OM組（β-gp10mM）+JNK氨基末端蛋白蛋白激酶抑制劑 第16組:對照組2+AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑 第17組:成骨OM組（β-gp10mM）+AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑 第二部分：促腎上腺皮質(zhì)激素對小鼠BMMSCs成骨分化的影響-實(shí)驗(yàn)分組 第1組:對照組：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液(低糖細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）+胎牛血清（FBS）+抗壞血酸鈉（AA50ug/ml）+100μg/ml青霉素G和100μg鏈霉素（P/S），BM組) 第2組:對照組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M) 第3組:對照組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M) 第4組:對照組+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)，成骨OM組 第5組:成骨OM組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M) 第6組:成骨OM組+促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M) 3.礦化染色:培養(yǎng)小鼠BMMSCs6-7天后，通過Arlizarin Red(茜素紅)染色法評價(jià)小鼠BMMSCs骨化程度 4.基因表達(dá):培養(yǎng)小鼠BMMSCs1天、3天、6天，然后萃取不同時(shí)間細(xì)胞中的RNA，然后采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)，定量分析成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平及ACTH對其相關(guān)基因水平表達(dá)的影響。 5.蛋白質(zhì)水平:培養(yǎng)小鼠BMMSCs15分鐘和60分鐘，萃取不同時(shí)間細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成分，采用蛋白印跡（Western Blotting）技術(shù)，分析成骨分化相關(guān)基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;在加有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)的成骨培養(yǎng)液中培養(yǎng)小鼠BMMSCs3天和6天后，萃取不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)成分，采用蛋白印跡（Western Blotting）技術(shù)，分析促腎上腺皮質(zhì)激素對其成骨分化相關(guān)基因蛋白質(zhì)水平表達(dá)的影響。 結(jié)果 1.小鼠BMMSCs成骨分化：培養(yǎng)細(xì)胞6-7天后，Alizarin Red(茜素紅)染色結(jié)果顯示：第6組：抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid, AA50ug/ml）+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)骨化程度高于第5組抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid,AA10ug/ml）+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)和第4組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)不添加抗壞血酸鈉（AscorbicAcid,AA），說明抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid, AA）在小鼠BMMSCs成骨分化過程中有促進(jìn)的礦化的作用，同時(shí)第6組抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid, AA50ug/ml）+β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)礦化程度明顯高于第7組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp1mM)不添加抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid, AA）和第9組β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp1mM)+抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid,AA50ug/ml）,說明β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)在成骨分化過程中對成骨的促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp1mM);由第10組到第17組結(jié)果顯示：JNK氨基末端蛋白激酶抑制劑和AKT蘇氨酸蛋白激酶抑制劑促進(jìn)成骨分化，p38MAPK絲裂原活化蛋白激酶抑制劑抑制成骨分化；在相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)成骨的組中15分鐘，60分鐘的Runx2,p-p38, BSP,p-AKT的表達(dá)有明顯的改變。 2.促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）對小鼠BMMSCs成骨分化的影響：促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)對礦化有明顯的抑制作用，而促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M)對礦化作用影響不明顯；促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)對成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受體（MC3R）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGFa）的表達(dá)水平具有抑制作用，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-9M)對成骨基因Runx2、黑色素3蛋白受體（MC3R）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGFa）的表達(dá)水平作用不明顯,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在加有促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)的組中，，Runx2、BSP和P-P38的蛋白質(zhì)表達(dá)水平有下降的趨勢。 結(jié)論 1.在小鼠BMMSCs成骨分化過程中，抗壞血酸鈉（Ascorbic Acid,AA50ug/ml）和β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate, β-gp10mM)有促進(jìn)成骨分化作用，包括促進(jìn)礦化和在基因水平和蛋白水平對成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2有明顯的促進(jìn)作用。 2.促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH10-8M)對小鼠BMMSCs成骨分化有抑制作用，而且在基因水平和蛋白水平對成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2有明顯的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：促腎上腺皮質(zhì)激素 小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 β-甘油磷酸鹽 抗壞血酸鈉
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 英文縮略詞表13-14
• 引言14-16
• 第一章 小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成骨分化16-28
• 材料與方法16-25
• 結(jié)果25-26
• 討論26-28
• 第二章 促腎上腺皮質(zhì)激素對小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)成骨分化的影響28-42
• 材料與方法28-39
• 結(jié)果39-40
• 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-45
• 附圖45-53
• 綜述53-63
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 個(gè)人簡歷63-65
• 致謝65

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本文編號：362682