發(fā)布時(shí)間：2017-05-13 11:01

  本文關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是一種病因復(fù)雜并嚴(yán)重危害家庭幸福的疾病。細(xì)胞凋亡是自然流產(chǎn)的發(fā)生基礎(chǔ)。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜，主要包括遺傳缺陷、解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、免疫因素、感染、血栓及環(huán)境因素等。但目前超過(guò)50%以上的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者不能找到明確病因。TP53可誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化以及DNA修復(fù)。TP53基因的各種功能主要是通過(guò)激活或抑制其下游基因來(lái)完成的。TP53蛋白介導(dǎo)其下游基因CDKN1A和BAX是與凋亡相關(guān)的重要信號(hào)通路。TP53可介導(dǎo)下游效應(yīng)蛋白CDKN1A的表達(dá)，將細(xì)胞阻斷于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)AX具有促凋亡的作用，其在TP53的激活下直接啟動(dòng)線粒體相關(guān)的凋亡通路。因此本研究以人正常早期妊娠及不明原因自然流產(chǎn)的絨毛組織標(biāo)本為對(duì)象,檢測(cè)絨毛組織細(xì)胞凋亡情況及調(diào)節(jié)基因TP53和其下游基因CDKN1A、BAX的表達(dá),以探討細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白TP53及其下游基因CDKN1A、BAX在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：選取有復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史患者為實(shí)驗(yàn)組，共30例，選取有正常生育史婦女為對(duì)照組，共30例。所有入選患者尿液中HCG均呈陽(yáng)性。入選者均通過(guò)負(fù)壓吸引術(shù)獲得的絨毛組織。其中一部分絨毛組織凍存于-196℃液氮中，以備PCR實(shí)驗(yàn)用。另一部分在室溫經(jīng)10%福爾馬林固定過(guò)夜后石蠟包埋，切片厚度5μm，貼于涂有APES的載玻片上，以備免疫組化及凋亡染色實(shí)驗(yàn)用。 1TP53蛋白的檢測(cè) 利用免疫組化的方法，以TP53特異性一抗與組織內(nèi)相關(guān)抗原結(jié)合，并通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶處理后的即用型二抗與一抗結(jié)合將抗原放大，然后借助DAB顯色劑將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來(lái)，在蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色后使用中性樹(shù)膠封片。每個(gè)樣品選取3個(gè)視野（200倍放大）拍照，每個(gè)視野照片都使用Photoshop CS5軟件計(jì)算灰度，然后取3個(gè)視野的平均值作為該樣品的平均灰度值。 2CDKN1A、BAX mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)法進(jìn)行CDKN1A和BAX mRNA相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)。絨毛組織提取總RNA，步驟如下：液氮凍存的絨毛組織經(jīng)液氮研磨后，加入1mL Trizol混勻，取500μL懸液加入200μL氯仿混勻后12000rpm離心15min，取上層清液與等體積異丙醇混勻后12000rpm離心15min，75%乙醇洗滌沉淀后，，沉淀溶解于50μLRNase-free水中。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastQuant RT Kit (With gDNase)，說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95℃，30sec；PCR擴(kuò)增：95℃，3sec；60℃，30sec；84℃，1sec；40個(gè)循環(huán)，84℃讀取熒光。2-△△Ct法計(jì)算CDKN1A、BAX mRNA在絨毛組織中的相對(duì)表達(dá)量。 3細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）對(duì)絨毛細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)流程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作（DeadEnd Fluorometric TUNEL System）。最后使用SlowFade Gold Antifade Reagentwith DAPI對(duì)樣品進(jìn)行封片。在熒光顯微鏡觀察以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色顆粒作為陽(yáng)性細(xì)胞，既凋亡細(xì)胞。每個(gè)樣品選取3個(gè)視野（100倍放大），每個(gè)視野在熒光顯微鏡下用520nm波長(zhǎng)拍照一次（綠色TUNEL），然后用430nm波長(zhǎng)拍照一次（藍(lán)紫色DAPI），使用Photoshop CS5將兩張照片進(jìn)行合成。最后使用Image-Pro Plus6.0進(jìn)行熒光分析。 結(jié)果： 1絨毛組織中TP53蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示TP53蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核中，呈黃色或者棕黃色顆粒。TP53蛋白在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛組織中表達(dá)量顯著性高于正常絨毛組織。對(duì)正常組和實(shí)驗(yàn)組絨毛組織標(biāo)本中TP53蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行陽(yáng)性評(píng)定。對(duì)照組平均灰度顯著高于實(shí)驗(yàn)組，兩組比較P=0.000，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 2絨毛組織中CDKN1A和BAX mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示與正常組的mRNA水平比較，實(shí)驗(yàn)組患者的絨毛組織中CDKN1A mRNA水平顯著性上調(diào)，兩組比較P=0.015具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。實(shí)驗(yàn)組患者的絨毛組織中BAX mRNA水平顯著性高于對(duì)照組，兩組比較P=0.019差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3絨毛組織的細(xì)胞凋亡 TUNEL檢測(cè)顯示對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組患者的絨毛組織的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞中均有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，但是對(duì)照組的凋亡細(xì)胞較少，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞較多。兩組比較P=0.024，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論：TP53誘導(dǎo)其信號(hào)通路的下游基因CDKN1A和BAX異常表達(dá)在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生過(guò)程中可能起到了重要的作用。TP53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路可能是導(dǎo)致妊娠期婦女出現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的原因之一。
【關(guān)鍵詞】：復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 細(xì)胞凋亡 TP53 CDKN1A BAX
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R321
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11
• 材料與方法11-18
• 結(jié)果18-20
• 附圖20-24
• 附表24-26
• 討論26-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 綜述 TP53 及其下游基因 CDKN1A、BAX 與婦科疾病32-43
• 參考文獻(xiàn)38-43
• 致謝43-44
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷44

【引證文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 閆清雅;壽胎丸對(duì)HLA-G免疫信號(hào)通路的影響及機(jī)制初步研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛組織中細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：362340