本文關(guān)鍵詞：質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188對(duì)hemin誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞自噬與凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：Hemin可以引起細(xì)胞質(zhì)膜損傷并導(dǎo)致質(zhì)膜完整性的破壞，并進(jìn)一步導(dǎo)致繼發(fā)性損傷的發(fā)生。本研究期望通過建立體外腦出血模型—hemin損傷模型，探索質(zhì)膜破壞對(duì)腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的影響，并探討質(zhì)膜修復(fù)劑P188是否存在神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。 方法：運(yùn)用小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系，采用適當(dāng)濃度的hemin（30μM）建立體外出血模型。CCK-8試劑盒檢測(cè)海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞的存活率；熒光染料碘化丙啶（PI）檢測(cè)hemin誘導(dǎo)的質(zhì)膜完整性的破壞程度；Western Blot檢測(cè)hemin處理后自噬相關(guān)蛋白LC3，Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bcl-2蛋白的表達(dá)；給予自噬抑制劑3-MA（10mM）及mTOR抑制劑Rapamycin（100nM）后，通過CCK-8及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)自噬在神經(jīng)細(xì)胞損傷中所起的作用；給予質(zhì)膜修復(fù)劑泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通過CCK-8檢測(cè)P188對(duì)hemin引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響；Western Blot檢測(cè)P188對(duì)模型中神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白LC3，Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bcl-2的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P188對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）變化的影響；給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，WesternBlot檢測(cè)NAC對(duì)模型中神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白LC3，Beclin1和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，，Bcl-2的影響。 結(jié)果：（1）利用hemin法成功的建立了神經(jīng)元細(xì)胞體外出血模型。CCK-8結(jié)果證實(shí)了hemin處理后對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷是劇烈的，并且具有時(shí)間及濃度相關(guān)性。PI熒光結(jié)果顯示hemin處理后質(zhì)膜完整性遭到破壞。（2）hemin可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡及自噬，且自噬在細(xì)胞死亡中扮演損害作用。Western Blot結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1蛋白在hemin處理后逐步上升（P0.05），凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3也隨時(shí)間地延長(zhǎng)逐步上升，抗凋亡蛋白Bcl-2顯著減低（P0.05）。在加入3-MA后，其損傷相對(duì)于單純hemin處理明顯降低，而Rapamycin則進(jìn)一步加劇了hemin的損傷作用，提示自噬在hemin引起的神經(jīng)損傷中扮演促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用。（3）質(zhì)膜修復(fù)劑P188具有神經(jīng)保護(hù)作用。在加入質(zhì)膜修復(fù)劑P188后，PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯減少（P0.05），Western Blot結(jié)果顯示LC3，Beclin1及Caspase-3蛋白的表達(dá)也明顯的減低（P0.05），而Bcl-2的表達(dá)顯著上升（P0.05），免疫熒光技術(shù)結(jié)果顯示TUNEL（+）/Beclin1（+）也明顯的減少（P0.05）。（4）P188可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS，這可能是其具有抗凋亡及抗自噬功能的機(jī)制之一。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的表達(dá)水平，結(jié)果顯示P188顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，而抗氧化劑NAC也顯著減少ROS的產(chǎn)生。加入NAC后，Western Blot結(jié)果顯示LC3，Beclin1和Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著降低（P0.05），Bcl-2蛋白的表達(dá)水平回升，而NAC與P188聯(lián)合給藥時(shí)，與單獨(dú)給NAC相比，其損傷程度無明顯改善（P0.05），且各種蛋白表達(dá)水平也無明顯差異，提示P188可能是通過減少細(xì)胞內(nèi)ROS的水平進(jìn)而調(diào)節(jié)自噬及凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。 結(jié)論：1. Hemin對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生致死性損傷，且伴隨有質(zhì)膜的破壞。2. Hemin產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡伴隨有自噬與凋亡的發(fā)生。3.自噬在神經(jīng)元hemin處理中起損傷作用，即可能為自噬性細(xì)胞死亡。4.質(zhì)膜修復(fù)劑P188對(duì)神經(jīng)元hemin處理后具有保護(hù)作用。5.活性氧在hemin誘導(dǎo)神經(jīng)損傷中起重要作用，抑制活性氧的產(chǎn)生可以調(diào)節(jié)hemin誘導(dǎo)的自噬與凋亡。6. P188可以通過減少活性氧的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)自噬與凋亡。
【關(guān)鍵詞】：腦出血 Hemin 自噬 凋亡 P188 活性氧
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-12
• 第一部分 HEMIN 引起神經(jīng)細(xì)胞死亡方式的研究12-23
• 材料與方法13-18
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-21
• 小結(jié)21-23
• 第二部分 P188 對(duì) HEMIN 引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡的影響及其機(jī)制的研究23-41
• 第一節(jié) P188 對(duì) HEMIN誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡的影響23-33
• 材料與方法23-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-33
• 第二節(jié) P188 具有神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制33-40
• 材料與方法33-36
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-40
• 小結(jié)40-41
• 討論41-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 綜述55-67
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 攻讀研究生學(xué)位期間發(fā)表的論文67-68
• 縮略詞68-69
• 致謝69-70

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