發(fā)布時(shí)間：2017-05-12 08:16

  本文關(guān)鍵詞：人源抗炭疽毒素中和抗體Fab的制備及體外活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：炭疽（anthrax）是一種由革蘭氏陽(yáng)性的炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）引起的急性傳染病，主要通過(guò)皮膚、呼吸道和消化道感染動(dòng)物和人[1]。炭疽桿菌引起人患病的主要機(jī)制主要包括兩方面：1.炭疽芽胞最初感染巨噬細(xì)胞，裂解巨噬細(xì)胞而后進(jìn)入血液引起敗血癥和毒血癥導(dǎo)致機(jī)體死亡；2.炭疽芽孢桿菌在血液中可以產(chǎn)生大量芽胞并釋放兩種炭疽毒素：致死毒素（lethal toxin, LeTx）和水腫毒素（edema toxin, EdTx）[2]。炭疽致死毒素由保護(hù)性抗原（protective antigen,PA）和致死因子（lethal factor, LF）組成[3]。人們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，抗保護(hù)性抗原（PA）的抗體不但可以中和炭疽毒素，還可以在體內(nèi)殺死芽胞，起到較好的保護(hù)性作用。 噬菌體抗體庫(kù)展示技術(shù)是近年發(fā)展的生物學(xué)新技術(shù)，它改變了抗體制備的傳統(tǒng)途徑[4]。噬菌體抗體庫(kù)可以模擬機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能，，使人們?cè)隗w外就可以獲得特異性的抗體[5,6]。本研究擬以噬菌體展示技術(shù)篩選人源抗炭疽保護(hù)性抗原的抗體Fab片段，并對(duì)篩選獲得的Fab進(jìn)行表達(dá)、純化及功能鑒定。 方法： 1.利用抗原固相篩選的方法，篩選人源噬菌體抗體庫(kù)（Fab抗體庫(kù)）。固相篩選以His-PA63融合蛋白為篩選抗原，經(jīng)吸附、洗脫和擴(kuò)增這三個(gè)循環(huán)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(phage enzyme linked immunosorbentassay,phage ELISA)進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定。通過(guò)多輪篩選，獲得兩個(gè)人源抗PA63抗體Fab，分別命名為PA63Fab-30、PA63Fab-34。 2.將篩選到的特陽(yáng)性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10F’，誘導(dǎo)表達(dá)PA63Fab-30、PA63Fab-34抗體。 3.將誘導(dǎo)表達(dá)的A63Fab-30、PA63Fab-34用Protein L親和層析柱純化，純化后的抗體片段經(jīng)ELISA、SDS-PAGE、Western-bolt進(jìn)行分析。 4.通過(guò)細(xì)胞殺傷試驗(yàn)檢測(cè)抗PA63Fab抗體片段對(duì)致死毒素的中和作用，比較PA63Fab-30、PA63Fab-34中和活性高低。 結(jié)果： 1.陽(yáng)性克隆的核酸序列分析結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)獲得的第30號(hào)和34號(hào)2株抗體的基因序列正確，輕鏈均為κ鏈，分別命名為PA63Fab-30、PA63Fab-34。 2. PA63Fab-30、PA63Fab-34轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)可以表達(dá)并正確組裝；經(jīng)Protein L親和層析柱純化，獲得了純度較高的抗體。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，兩株抗體能夠與His-PA63融合蛋白特異性結(jié)合。 3.體外中和試驗(yàn)證實(shí)，人源抗體PA63Fab-30抗體片段可有效抑制炭疽桿菌的致死毒素對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，在10μg/ml的LF濃度下，保護(hù)率高達(dá)79.2%。 結(jié)論： 1.通過(guò)全人源噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，采用固相篩選方法可以獲得抗PA63抗體片段Fab。運(yùn)用原核表達(dá)技術(shù)，優(yōu)化表達(dá)條件使Fab可在原核生物E.coli.TOP10F’中可溶性表達(dá)。 2.穩(wěn)定表達(dá)抗PA63抗體片段Fab，在體外中和試驗(yàn)中，可以在體外對(duì)細(xì)胞起到較好的保護(hù)性作用。原核表達(dá)的抗體可以正確組裝具有生物活性的抗炭疽毒素的特異性抗體片段。本研究制備的抗體片段可以與EF或LF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PA63分子，或者抑制PA形成七聚體，阻斷炭疽毒素進(jìn)入體內(nèi)，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的作用。
【關(guān)鍵詞】：噬菌體展示 炭疽保護(hù)性抗原 人源抗體Fab
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 前言9-12
• 論文研究一 人源抗炭疽保護(hù)性抗原 PA63 的抗體 Fab 的篩選與鑒定12-29
• 1.材料與方法12-22
• 2.結(jié)果22-27
• 3.討論27-29
• 論文研究二 人源抗炭疽保護(hù)性抗原 PA63 的抗體 Fab 的表達(dá)、純化與中和活性分析29-44
• 1.材料與方法29-34
• 2.結(jié)果34-41
• 3.討論41-44
• 小結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 附錄1：文獻(xiàn)綜述49-55
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 附錄255-56
• 附錄356-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 潘陽(yáng);王露楠;;噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的構(gòu)建及應(yīng)用研究進(jìn)展[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2011年03期

2 陳鳴,府偉靈;噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)——基因工程抗體的重大進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè);2001年03期

3 付登峰;胡建和;劉興友;;抗菌肽基因工程表達(dá)技術(shù)研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2010年09期

4 潘博;童貽剛;;噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2010年04期

5 鄭光宇,趙榮樂(lè);炭疽與炭疽桿菌[J];生物學(xué)通報(bào);2001年12期

6 秦思遠(yuǎn);董關(guān)木;;噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)的研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2009年02期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王謙;抗鏈霉素單克隆抗體制備與ELISA方法的建立[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：人源抗炭疽毒素中和抗體Fab的制備及體外活性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：359256