本文關(guān)鍵詞：基于慢病毒載體和轉(zhuǎn)錄因子的人角膜基質(zhì)細(xì)胞重編程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：多能干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)、組織工程和藥物發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)等領(lǐng)域極具應(yīng)用價(jià)值，科學(xué)家們?cè)鴩L試通過多種途徑獲取人的多能干細(xì)胞。但是現(xiàn)存方法的廣泛應(yīng)用在技術(shù)、細(xì)胞來源、免疫排斥、倫理、宗教或法律等方面存在諸多限制，而iPS細(xì)胞能夠克服這些問題的限制，被譽(yù)為生命科學(xué)領(lǐng)域新的里程碑。隨著人類對(duì)干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷加深，從人的iPS細(xì)胞將會(huì)衍生出更多種類的人類細(xì)胞，，iPS技術(shù)將成為細(xì)胞替代治療、新藥篩選與評(píng)價(jià)及其它用途（如提供大量的種子細(xì)胞）的基礎(chǔ)。 在組織工程人角膜基質(zhì)的工作中，基質(zhì)細(xì)胞是核心內(nèi)容之一。人角膜基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)有良好的增殖能力，而且能夠長期發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，獲得數(shù)量足夠、有再生活力的人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞是組織工程開展研究的前提和基礎(chǔ)。人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞的來源多種，包括異體細(xì)胞和自體細(xì)胞。在臨床應(yīng)用中，異體細(xì)胞容易產(chǎn)生免疫排斥，這極大限制了它的應(yīng)用。自體細(xì)胞獲取也有一定的困難：由于體細(xì)胞的體外增殖有一定限度，無法從很小的角膜基質(zhì)組織中獲得大量的細(xì)胞，而獲取大量角膜基質(zhì)組織又容易對(duì)正常角膜的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞；其他類型的自體細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞或脂肪干細(xì)胞，亦不能完全替代角膜基質(zhì)細(xì)胞的功能，無法成為組織工程角膜基質(zhì)理想的種子細(xì)胞。 人胚胎干細(xì)胞在體外有分化成各種細(xì)胞類型的能力，iPS細(xì)胞的發(fā)明讓人們可以從自身體細(xì)胞獲得大量的、無免疫原性的多能干細(xì)胞，因此iPS細(xì)胞來源的角膜基質(zhì)細(xì)胞成為了組織工程人角膜基質(zhì)種子細(xì)胞的非常有希望的候選。但是由于人們?cè)谌私悄せ|(zhì)細(xì)胞分化的分子機(jī)制方面缺少足夠的研究，導(dǎo)致很難在體外定向地將iPS細(xì)胞分化成足夠多的、純凈的角膜基質(zhì)細(xì)胞用于臨床。最近有大量研究證實(shí)iPS細(xì)胞帶有來源細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)記憶，iPS細(xì)胞基因組中與來源細(xì)胞有關(guān)聯(lián)的甲基化組也影響了它們的分化傾向，這一發(fā)現(xiàn)啟示我們可以充分利用iPS細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)記憶，來完成那些困難的定向分化。 本文中我們首先對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了原代培養(yǎng)。將去除上皮和內(nèi)皮細(xì)胞層的人角膜基質(zhì)進(jìn)行機(jī)械分割，在培養(yǎng)板上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，后將遷出的角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的人角膜基質(zhì)細(xì)胞具有樹突狀形狀特征，核型鑒定發(fā)現(xiàn)其染色體具有人類染色體的典型特征，免疫熒光檢測表明體外培養(yǎng)的基質(zhì)細(xì)胞均為波形蛋白陽性表達(dá)，且不含角膜上皮細(xì)胞和角膜內(nèi)皮細(xì)胞。 隨后我們用293T細(xì)胞以及第二代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)制作了分別攜帶Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種外源性基因的慢病毒，感染效率測定發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量之比為10:1時(shí)，感染效率超過80%。我們用四種病毒共同感染角膜基質(zhì)細(xì)胞，感染后將細(xì)胞消化、接種到預(yù)先鋪有Matrigel基質(zhì)膠的培養(yǎng)板上，將培養(yǎng)液換為小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)液，開始iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后第三天細(xì)胞開始出現(xiàn)了形態(tài)的改變，產(chǎn)生大量上皮樣及圓形的細(xì)胞，誘導(dǎo)后第七天到第九天，培養(yǎng)板中開始出現(xiàn)人胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞類型，它們的核質(zhì)比較大，細(xì)胞連接緊密，成克隆樣生長。誘導(dǎo)第二十天，胚胎干細(xì)胞樣的細(xì)胞團(tuán)已經(jīng)非常明顯，我們進(jìn)行了多能性干細(xì)胞的功能標(biāo)志之一，堿性磷酸酶染色，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)板中有大量堿性磷酸酶陽性細(xì)胞，初步確定已成功誘導(dǎo)人角膜基質(zhì)細(xì)胞成為iPS細(xì)胞，誘導(dǎo)效率為0.4%-0.8%。 綜上所述，本文將人角膜基質(zhì)細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，賦予角膜基質(zhì)細(xì)胞無限的增殖能力，為獲得大量的種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。我們希望在不久的將來，在此工作的基礎(chǔ)上利用iPS細(xì)胞表觀遺傳學(xué)記憶，使大量擴(kuò)增的角膜基質(zhì)細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞重新定向分化為角膜基質(zhì)細(xì)胞，滿足組織工程對(duì)種子細(xì)胞的需求。另外我們還可以將此iPS細(xì)胞分化為跟角膜基質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育上關(guān)系相近的角膜中其它類型的細(xì)胞，比如說角膜內(nèi)皮細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞，從而獲得這些數(shù)量稀少且在體外難于培養(yǎng)的細(xì)胞類型，用于疾病治療或理論研究。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 人角膜基質(zhì)細(xì)胞 Yamanaka因子 慢病毒 重編程
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：Q813;R329.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1. 發(fā)育過程中的多能干細(xì)胞13-15
• 1.1 胚胎干細(xì)胞13-14
• 1.2 外胚層干細(xì)胞14
• 1.3 胚胎生殖細(xì)胞和成體生殖系干細(xì)胞14-15
• 2. 多能干細(xì)胞的分類15-16
• 2.1 兩種基本的多能性狀態(tài)15-16
• 2.2 兩種多能性狀態(tài)的維持和轉(zhuǎn)化16
• 3. 人胚胎干細(xì)胞16-19
• 3.1 人胚胎干細(xì)胞的多能性狀態(tài)16-17
• 3.2 人胚胎干細(xì)胞在研究中遇到的問題17
• 3.3 核移植技術(shù)17-18
• 3.4 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS 細(xì)胞）18-19
• 4. 胚胎干細(xì)胞與 iPS 細(xì)胞的異同19-22
• 4.1 iPS 細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的多能性基因表達(dá)相近19-20
• 4.2 iPS 細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞的功能相似20
• 4.3 iPS 細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞之間存在的差異20-22
• 5. iPS 細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)記憶22-25
• 第二章 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定25-32
• 1. 材料用品25-26
• 1.1 材料25-26
• 1.2 主要儀器26
• 1.3 藥品與耗材26
• 1.4 常用溶液26
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 2.1 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)26
• 2.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)26-27
• 2.3 人角膜基質(zhì)細(xì)胞核型分析27
• 2.4 人角膜基質(zhì)細(xì)胞免疫化學(xué)檢測27
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 3.1 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)27-28
• 3.2 人角膜基質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)28
• 3.3 人角膜基質(zhì)細(xì)胞染色體核型分析28
• 3.4 人角膜基質(zhì)細(xì)胞特征蛋白的免疫化學(xué)檢測28-29
• 4 討論29-32
• 第三章 從人角膜基質(zhì)細(xì)胞到誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞32-44
• 1 材料用品32-33
• 1.1 材料32
• 1.2 藥品與耗材32-33
• 1.3 常用溶液配方33
• 2 實(shí)驗(yàn)方法33-35
• 2.1 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及提取33-34
• 2.2 慢病毒的產(chǎn)生和滴度測定34
• 2.3 慢病毒最佳 MOI 測定34
• 2.4 iPS 細(xì)胞的誘導(dǎo)34-35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-40
• 3.1 質(zhì)粒的提取及酶切鑒定35-36
• 3.2 用 293T 細(xì)胞包裝慢病毒36-37
• 3.3 用 293T 細(xì)胞測量病毒滴度37-38
• 3.4 確定病毒感染人角膜基質(zhì)細(xì)胞的最佳 MOI38-39
• 3.5 人 iPS 細(xì)胞的誘導(dǎo)39-40
• 3.6 人 iPS 細(xì)胞誘導(dǎo)效率測定40
• 4 討論40-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝（一）49-50
• 致謝（二）50-51
• 附件51-52

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：基于慢病毒載體和轉(zhuǎn)錄因子的人角膜基質(zhì)細(xì)胞重編程研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：358925