本文關(guān)鍵詞：ACT和ICL基因在隱球菌抗饑餓反應(yīng)中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)是一種重要的人體條件致病性真菌,主要感染艾滋病患者以及長期接受大量固醇類藥物治療的病人,是臨床上真菌性腦膜炎的主要病原菌。隱球菌(新型隱球酵母)可以在細胞免疫受損人體的巨噬細胞中長期潛伏并最終復(fù)活和繁殖,擴散至大腦,導(dǎo)致隱球性腦膜炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。已有的研究表明VPS41基因在隱球菌的體外抗饑餓反應(yīng)、巨噬細胞中的存活及致病性中起關(guān)鍵作用。為了鑒定參與VPS41抗饑餓反應(yīng)信號通路的相關(guān)成員,本課題利用數(shù)字基因表達譜確定在氮源饑餓條件下隱球酵母野生型菌株H99與VPS41基因功能缺失突變株vps41△中轉(zhuǎn)錄表達呈顯著差異的基因。對其中的2個表達水平顯著下調(diào)的基因ACT(乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)和ICL(異檸檬酸裂合酶基因)進行了基因定向敲除,獲得了隱球酵母ACT缺陷型act△、ICL缺陷型iclA重組菌,并構(gòu)建了功能回補菌株act△::ACT、 icl△::ICL。體外48 h氮源饑餓試驗結(jié)果顯示：(1)野生型H99、突變株actA、回補菌株act△::ACT的存活率分別為86.93%、4.52%、59.92%；(2)突變株icl△、回補菌株icl△::ICL的存活率分別為5.76%、76.90%。以上結(jié)果表明ACT和ICL基因在隱球菌的體外抗饑餓反應(yīng)中具有重要的作用。利用qRT-PCR研究了ACT, ICL的表達水平與VPS41功能的潛在關(guān)系,發(fā)現(xiàn)VPS41缺陷導(dǎo)致ACT、ICL的表達水平的顯著降低,表明乙酰轉(zhuǎn)移酶(ACT)、異檸檬酸裂合酶(ICL)不僅參與隱球酵母的體外抗饑餓反應(yīng),影響?zhàn)囸I環(huán)境下的生存率,并且其表達水平受到VPS41饑餓信號通路的調(diào)控。以上研究結(jié)果為進一步了解VPS41基因調(diào)控隱球菌饑餓應(yīng)答反應(yīng)的分子機制,鑒定饑餓信號通路中的其他關(guān)鍵基因奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：新型隱球酵母 饑餓反應(yīng) 乙酰轉(zhuǎn)移酶 異檸檬酸裂合酶
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R379
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-19
• 1.1 新型隱球酵母的概述8-10
• 1.1.1 新型隱球酵母的分類和分布8
• 1.1.2 新型隱球菌致病途徑8-10
• 1.2 新型隱球酵母致病因子10-13
• 1.2.1 莢膜10-11
• 1.2.2 具有37℃條件下的生存能力11-12
• 1.2.3 漆酶12
• 1.2.4 抗饑餓反應(yīng)因子12-13
• 1.3 饑餓反應(yīng)信號通路13-15
• 1.3.1 細胞對營養(yǎng)饑餓的感應(yīng)和應(yīng)答13-14
• 1.3.2 TOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑14
• 1.3.3 新型隱球酵母的氮源饑餓14-15
• 1.4 數(shù)字基因表達譜15-16
• 1.5 乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(ACT)和異檸檬酸裂合酶基因(ICL)16-17
• 1.6 驗證基因功能的策略17
• 1.7 本論文的研究內(nèi)容及意義17-19
• 1.7.1 研究內(nèi)容17-18
• 1.7.2 研究意義18-19
• 2 材料與方法19-41
• 2.1 材料19-27
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒19
• 2.1.2 工具酶及相關(guān)試劑19-22
• 2.1.3 主要儀器和設(shè)備22-23
• 2.1.4 引物23-24
• 2.1.5 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件24-25
• 2.1.6 主要溶液25-27
• 2.2 方法27-41
• 2.2.1 ACT、ICL在vps41△中恢復(fù)表達27
• 2.2.2 vps41△：：ACT、vps41△：：ICL菌株中ACT、ICL的表達水平分析27-29
• 2.2.3 敲除載體pKH-ACT和pKH-ICL的構(gòu)建29-34
• 2.2.4 電轉(zhuǎn)化法分別敲除WT菌株的ACT和ICL34-37
• 2.2.5 回補載體pKU-ACT和pKU-ICL的構(gòu)建37-38
• 2.2.6 5-氟乳清酸對敲除突變株的誘導(dǎo)38
• 2.2.7 電轉(zhuǎn)化法回補act△和icl△38-39
• 2.2.8 敲除突變株與回補菌株的抗饑餓能力的檢測39
• 2.2.9 熒光定量PCR分別檢測ACT和ICL的表達水平39-40
• 2.2.10 待測菌株在小鼠(BALB/c)模型中致病能力的檢測40-41
• 3 結(jié)果與討論41-61
• 3.1 組成型表達ACT、ICL對vps41△抗饑餓能力的影響41
• 3.2 熒光定量PCR分別檢測ACT、ICL的表達水平41-43
• 3.2.1 TRIZOL試劑法提取RNA42-43
• 3.2.2 熒光定量PCR驗證43
• 3.3 敲除載體pKH-ACT和pKH-ICL的構(gòu)建43-46
• 3.3.1 PCR擴增敲除載體的左臂、右臂43-44
• 3.3.2 HYG片段和載體骨架pBlue KS的酶切44-45
• 3.3.3 敲除載體的構(gòu)建45-46
• 3.4 敲除突變株的篩選與驗證46-48
• 3.4.1 敲除突變株的篩選46-47
• 3.4.2 敲除突變株的驗證47-48
• 3.5 回補載體pKU-ACT和pKU-ICL的構(gòu)建48-51
• 3.5.1 URA5及載體骨架的獲取49
• 3.5.2 回補載體的構(gòu)建49-51
• 3.6 回補菌株的篩選與鑒定51-53
• 3.6.1 5-氟乳清酸對敲除突變株的誘導(dǎo)51-52
• 3.6.2 回補菌株的篩選與驗證52-53
• 3.7 待測菌株抗饑餓能力的檢測53-55
• 3.8 突變株和回補突變株的基因表達水平分析55-57
• 3.8.1 TRIZOL試劑法提取RNA55-56
• 3.8.2 act△和act△：：ACT中ACT基因的表達水平分析56
• 3.8.3 icl△和icl△：：ICL中ICL基因的表達水平分析56-57
• 3.9 探索ACT、ICL與VPS41之間的聯(lián)系57-59
• 3.9.1 檢測經(jīng)饑餓誘導(dǎo)后vps41△和vps41△：：VPS41中ACT基因的表達水平57-58
• 3.9.2 檢測經(jīng)饑餓誘導(dǎo)后vps41△和vps41△：：VPS41中ICL基因的表達水平58-59
• 3.10 待測菌株在小鼠(BALB/c)模型中致病能力的檢測59-61
• 4 結(jié)論61-62
• 5 展望62-63
• 6 參考文獻63-69
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文69-70
• 8 致謝70

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：ACT和ICL基因在隱球菌抗饑餓反應(yīng)中的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：358071