本文關(guān)鍵詞：重組人白介素-35的真核表達(dá)及生物功能的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白介素-35(Interleukin35, IL-35)是在2007年由Liew及Vignali兩個(gè)小組發(fā)現(xiàn)的,它是由EBI3和IL-12p35組成的異二聚體分子,是IL-12家族成員之一,其結(jié)構(gòu)與IL-12家族其他成員(IL-12、IL-23、IL-27)具有同源性。IL-35的受體是由IL12-Rβ2和gp130組成的異二聚體分子,它是通過(guò)由IL12-Rβ2和gpl30組成的異二聚體或者每條鏈的同源二聚體傳遞信號(hào)的。IL-35是一種主要由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell, Treg)分泌的抑制性細(xì)胞因子,它也能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一種新型的’Treg,被稱為iTr35. 本論文通過(guò)基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲得高純度的rhIL-35[rhIL-35-IgG1(Fc)],并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行研究。本論文主要包括以下三部分：第一,rhIL-35的構(gòu)建及表達(dá),該部分主要是構(gòu)建IL-35真核表達(dá)載體pSTEP2-EL35-LFc,并轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,利用親和色譜分離純化獲得重組人IL-35蛋白,通過(guò)SDS-PAGE及Western Blot鑒定蛋白的表達(dá)；第二,rhIL-35生物活性的檢測(cè),主要是通過(guò)酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)IL-35-Fc能夠與其受體鏈gpl30結(jié)合,并且在M1小鼠髓系白血病細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)重組人IL-35能夠中和gp130的生物學(xué)活性。另外,在M1細(xì)胞上rhIL-35對(duì)白血病抑制因子LIF具有拮抗作用。第三,重組人IL-35對(duì)T淋巴細(xì)胞的作用,主要涉及到重組人IL-35對(duì)CD3抗體和CD28抗體共同刺激的小鼠脾細(xì)胞及胸腺細(xì)胞的作用,重組人IL-35對(duì)CD3抗體刺激的PBMC的作用,結(jié)果表明均無(wú)明顯作用效果。 本研究成功制備了具有生物活性的人IL-35-IgGl(Fc)重組蛋白,發(fā)現(xiàn)IL-35能夠與其受體鏈gp130的結(jié)合,在M1小鼠髓系白血病細(xì)胞上對(duì)gp130具有中和作用并且對(duì)LIF具有拮抗作用。另外,重組人IL-35對(duì)CD3抗體和CD28抗體共刺激的T細(xì)胞無(wú)明顯的抑制或者促進(jìn)作用,也不能誘導(dǎo)T細(xì)胞向CD4+T細(xì)胞及CD4+CD25+T細(xì)胞分化,對(duì)CD3抗體活化的PBMC生長(zhǎng)也無(wú)抑制或者促進(jìn)作用。
【關(guān)鍵詞】：重組人白介素-35(rhIL-35-Fc) gp130 白血病抑制因子(LIF) M1小鼠髓系白血病細(xì)胞 T細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-11
• ~.略語(yǔ)表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 重組人IL-35的構(gòu)建及其表達(dá)14-26
• 一、實(shí)驗(yàn)材料14-17
• 1. 試劑14
• 2. 生物材料14
• 3. 器材14
• 4. 溶液配置14-17
• 二、實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 1. 質(zhì)粒DNA的提取17
• 2. 重組人IL-35載體的構(gòu)建17-20
• 2.1 PCR擴(kuò)增人IL-12p35和EBI3基因17-18
• 2.2 pSTEP2-IL35-LFc質(zhì)粒的構(gòu)建18
• 2.3 DNA瓊脂糖凝膠電泳18
• 2.4 DNA的酶切18-19
• 2.5 感受態(tài)菌的制備19
• 2.6 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化19
• 2.7 克隆的篩選與鑒定19-20
• 3. pSTEP2-IL35-LFc載體的轉(zhuǎn)染及表達(dá)20
• 4. 重組人IL-35的純化20
• 5. 重組人IL-35的鑒定20-22
• 5.1 IL-35-IgG1(Fc)的SDS-PAGE電泳20-21
• 5.2 IL-35-IgG1(Fc)去糖基化及鑒定21
• 5.3 Western Blot鑒定21-22
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-24
• 1. EBI3、IL-12p35基因PCR擴(kuò)增結(jié)果以及載體的獲得22-23
• 2. 重組人IL-35的鑒定結(jié)果23-24
• 2.1 IL-35-IgG1(Fc)的SDS-PAGE電泳結(jié)果23
• 2.2 IL-35-IgG1(Fc)的免疫印記鑒定結(jié)果23-24
• 四、討論24-26
• 第二部分 重組人IL-35的生物活性檢測(cè)26-34
• 一、實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 1. 主要試劑26
• 2. 細(xì)胞26
• 3. 儀器26
• 4. 溶液配制26-27
• 二、實(shí)驗(yàn)方法27-29
• 1. rhIL-35與gp130的結(jié)合作用27-28
• 1.1 gp130的生物素化27
• 1.2 酶聯(lián)免疫法(ELISA)27-28
• 2. rhIL-35對(duì)gp130的中和作用28
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)28
• 2.2 rhIL-35對(duì)M1細(xì)胞的作用28
• 2.3 rhIL-35對(duì)gp130中和活性的檢測(cè)28
• 3. rhIL-35對(duì)gp130的中和作用28-29
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)28
• 3.2 rhIL-35對(duì)LIF中和活性的檢測(cè)28-29
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-31
• 1. rhIL-35與gp130的結(jié)合作用29
• 2. rhIL-35對(duì)M1細(xì)胞的作用29-30
• 3. rhIL-35對(duì)gp130中和活性30-31
• 4. rhIL-35對(duì)LIF的拮抗作用31
• 四、討論31-34
• 第三部分 重組人IL-35對(duì)T細(xì)胞的作用34-44
• 一、實(shí)驗(yàn)材料34
• 1. 試劑34
• 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 3. 儀器34
• 4. 溶液配置34
• 二、實(shí)驗(yàn)方法34-36
• 1. rhIL-35對(duì)活化T細(xì)胞的作用34-35
• 1.1 小鼠脾細(xì)胞及胸腺細(xì)胞的分離34-35
• 1.2 rhIL-35對(duì)活化T淋巴細(xì)胞作用效果的檢測(cè)35
• 2. rhIL-35對(duì)CD4~+T細(xì)胞及CD4~+CD25~+T細(xì)胞的作用35-36
• 2.1 細(xì)胞處理35
• 2.2 細(xì)胞流式檢測(cè)35-36
• 3. rhIL-35對(duì)PBMC的作用36
• 3.1 PBMC的分離36
• 3.2 rhIL-35對(duì)PBMC的作用36
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-40
• 1. rhIL-35對(duì)活化的T細(xì)胞的作用結(jié)果36-37
• 2. rhIL-35對(duì)CD4~+T及CIM~+CD25~+T細(xì)胞的作用結(jié)果37-40
• 3. rhIL-35對(duì)PBMC的作用結(jié)果40
• 四、討論40-42
• 1. rhIL-35對(duì)活化的T淋巴細(xì)胞的作用41
• 2. rhIL-35對(duì)CD4~+T及CD4~+CD25~+T細(xì)胞的作用41-42
• 3. rhIL-35對(duì)PBMC的作用42
• 五、小結(jié)42-44
• 總結(jié)44-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 綜述 IL-12家族各成員及其受體的研究進(jìn)展48-60
• 一、IL-12家族各成員及其受體組成48-49
• 二、IL-12及其受體49-52
• 1. IL-12的分子結(jié)構(gòu)49-50
• 2. IL-12的受體50
• 3. IL-12的生物學(xué)功能50-51
• 3.1 IL-12誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子產(chǎn)生50-51
• 3.2 IL-23調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能51
• 4. IL-12的臨床應(yīng)用前景51-52
• 三、IL-23及其受體52-54
• 1. IL-23的分子結(jié)構(gòu)52
• 2. IL-23的受體52-53
• 3. IL-23的生物學(xué)功能53-54
• 3.3 IL-23是炎癥應(yīng)答的重要細(xì)胞因子53
• 3.4 IL-23促進(jìn)記憶T細(xì)胞的增殖53
• 3.5 IL-23作用于樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)53-54
• 4. IL-23的臨床應(yīng)用前景54
• 四、IL-27及其受體54-56
• 1. IL-27的分子結(jié)構(gòu)54
• 2. IL-27的受體54-55
• 3. IL-27的生物學(xué)功能55
• 4. IL-27的臨床應(yīng)用前景55-56
• 五、IL-35及其受體56-59
• 1. IL-35的分子結(jié)構(gòu)56
• 2. IL-35的受體56-57
• 3. IL-35的生物學(xué)功能57-58
• 3.1 IL-35對(duì)T細(xì)胞的作用57
• 3.2 IL-35可以緩解CIA57-58
• 4. IL-35的臨床應(yīng)用前景58-59
• 六、展望59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 致謝64

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  本文關(guān)鍵詞：重組人白介素-35的真核表達(dá)及生物功能的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：357852