本文關(guān)鍵詞：用番茄（Solanum lycopersicum）表達(dá)口服Norovirus亞單位疫苗，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：諾如病毒(Norovirus, NVs)是導(dǎo)致人類非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原,為一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒,屬于杯狀病毒科(Human Calicivirus, HuCV)諾如病毒屬(Norovirus, NV)的原型代表株。該病毒可以感染各年齡階段的人群,感染力僅次于輪狀病毒,在人群密集場所易發(fā)生聚集性爆發(fā),病情難以控制。目前臨床上尚無特效的抗病毒藥物來治療由該病毒引起的感染,主要以對癥或支持治療為主。近年來,該病毒時(shí)有大規(guī)模爆發(fā),疫苗己成為NVs預(yù)防和疫情爆發(fā)的重要手段,病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)也成為該領(lǐng)域研制的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),NVs的衣殼蛋白P粒子與人組織血型抗原(Histo-blood group antigen, HBGA)特異親和能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其VLPs,而P粒子作為亞基疫苗的研究鮮見報(bào)道。因此,利用植物系統(tǒng)表達(dá)P粒子可食性疫苗有望成為預(yù)防NVs傳染和爆發(fā)的有效手段。本研究按照番茄(Solanum lycopersicum)偏愛密碼子設(shè)計(jì)和合成了編碼VA387毒株衣殼蛋白P粒子的基因(.P(GENE),在其5’端引入編碼His-tag (6×His)的DNA序列,并將PGl ENE置于E8動(dòng)子下游,構(gòu)建E8::PGENE表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄下胚軸誘導(dǎo)植株再生。同時(shí),構(gòu)建含PGENE原核表達(dá)載體：pET32a-PGENE,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,在IPTG誘導(dǎo)下快速表達(dá)和純化P粒子,作為研究番茄表達(dá)口服NVs亞基疫苗的參照。對277株卡那霉素抗性植株P(guān)CRSouthern blotting分析,確認(rèn)獲得了14株整合有PGENE番茄植株；通過RT-PCR開Western blotting分析,確認(rèn)了PGENE在轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中成功表達(dá),靶蛋白表達(dá)量占總可溶蛋白的0.22%；在透射電鏡下確認(rèn)了真核(番茄)和原核(大腸桿菌)表達(dá)的P粒子聚合了球形；小鼠免疫實(shí)驗(yàn)顯示,在2個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的P粒子均可以獲得有活性的抗血清。該研究為用番茄表達(dá)口服NVs疫苗的研究作了必要的準(zhǔn)備。
【關(guān)鍵詞】：諾如病毒 P粒子 番茄 大腸桿菌 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-15
• 英文縮寫詞表15-18
• 第一章 文章綜述18-44
• 1.1 背景介紹18-20
• 1.1.1 病原學(xué)特征18-19
• 1.1.2 Norovirus的基因型分類19-20
• 1.2 Norovirus流行病學(xué)特征20-25
• 1.2.1 傳播概況20
• 1.2.2 傳染源、傳播方式和宿主易感性20-22
• 1.2.3 臨床癥狀22
• 1.2.4 臨床診斷治療和預(yù)防措施22
• 1.2.5 實(shí)驗(yàn)室檢測手段22-25
• 1.2.5.1 電鏡法23
• 1.2.5.2 免疫法23-24
• 1.2.5.3 分子生物學(xué)方法24-25
• 1.3 Norovirus基因組結(jié)構(gòu)特征25-31
• 1.3.1 Norovirus衣殼蛋白和VLPs26
• 1.3.2 P二聚體和P粒子26-28
• 1.3.3 Norovirus與HBGA之間的反應(yīng)模型28-31
• 1.4 Norovirus疫苗研究進(jìn)展31-33
• 1.5 植物可食性疫苗表達(dá)系統(tǒng)33-41
• 1.5.1 植物可食疫苗33-34
• 1.5.2 植物表達(dá)系統(tǒng)的分類34-36
• 1.5.2.1 穩(wěn)定整合系統(tǒng)34-35
• 1.5.2.2 瞬時(shí)整合系統(tǒng)35-36
• 1.5.3 植物可食性疫苗優(yōu)勢36
• 1.5.4 植物可食疫苗的研究現(xiàn)狀36-38
• 1.5.5 植物生產(chǎn)可食性疫苗瓶頸和解決策略38-41
• 1.5.5.1 外源蛋白表達(dá)量低，免疫劑量不確定39
• 1.5.5.2 服時(shí)活性易受影響39-40
• 1.5.5.3 植物疫苗生物安全性問題40-41
• 1.6 番茄受體表達(dá)系統(tǒng)的選擇41-44
• 1.6.1 受體植株的選擇41
• 1.6.2 番茄是較理想的.服疫苗生產(chǎn)受體植物41-42
• 1.6.3 本研究的目的和意義42-44
• 第二章 用大腸桿菌（ E scher ichia c oli）表達(dá)N V疫苗44-75
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料44-48
• 2.1.1 菌株和載體44
• 2.1.2 藥品44-45
• 2.1.3 試劑耗材45-46
• 2.1.4 試劑盒46
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備46-47
• 2.1.6 引物序列47-48
• 2.2 載體構(gòu)建48-56
• 2.2.1 基因合成48-49
• 2.2.2 構(gòu)建表達(dá)載體49-54
• 2.2.2.1 構(gòu)建流程如圖50
• 2.2.2.2 質(zhì)粒抽提50-51
• 2.2.2.3 酶切51-52
• 2.2.2.4 產(chǎn)物膠回收52-53
• 2.2.2.5 回收產(chǎn)物連接53
• 2.2.2.6 大腸桿菌（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞制備（CaCl2法）53-54
• 2.2.3 熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞54
• 2.2.4 陽性克隆載體的檢測和確定54-56
• 2.2.4.1 PCR檢測初步確定陽性克隆54-56
• 2.2.4.2 測序確定陽性克隆載體56
• 2.2.5 載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2156
• 2.3 P粒子誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白檢測56-63
• 2.3.1 P粒子溫度梯度和時(shí)間梯度誘導(dǎo)56
• 2.3.2 SDS-PAGE分離檢測蛋白56-58
• 2.3.3 P粒子Western Blotting分析58-60
• 2.3.4 外源蛋白的可溶性分析60
• 2.3.5 目的蛋白P粒子的純化60-62
• 2.3.6 純化目的蛋白濃度測定62-63
• 2.4 透射電鏡觀察P粒子形態(tài)63
• 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析63-73
• 2.5.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建63-65
• 2.5.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和檢測65-66
• 2.5.3 P粒子誘導(dǎo)表達(dá)及western blotting檢測66-69
• 2.5.4 目的蛋白可溶性的分析69-70
• 2.5.5 目的蛋白純化70-71
• 2.5.6 目的蛋白濃度測定71-72
• 2.5.7 電鏡觀察P粒子形態(tài)72-73
• 2.6 實(shí)驗(yàn)小結(jié)73-75
• 第三章 No rovir us P粒子在番茄中表達(dá)75-121
• 3.1 材料和試劑75-79
• 3.1.1 菌株和植物材料75
• 3.1.2 載體75-76
• 3.1.3 寡核苷酸引物76-77
• 3.1.4 試劑和耗材77-78
• 3.1.5 試劑盒78-79
• 3.1.6 主要儀器設(shè)備79
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法79-101
• 3.2.1 技術(shù)路線79-80
• 3.2.2 E8::PGENE載體構(gòu)建80-83
• 3.2.2.1 構(gòu)建思路80
• 3.2.2.2 質(zhì)粒提取80
• 3.2.2.3 酶切80-82
• 3.2.2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化DH5α82
• 3.2.2.5 陽性克隆載體的檢測和確定82-83
• 3.2.3 P粒子在番茄細(xì)胞中表達(dá)83-85
• 3.2.3.1、根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備83-84
• 3.2.3.2 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化84-85
• 3.2.4 再生番茄植株陽性篩選85-94
• 3.2.4.1 番茄植株的PCR檢測85-87
• 3.2.4.2 轉(zhuǎn)基因抗性植株的Southern blotting檢測分析87-94
• 3.2.5 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量94-98
• 3.2.5.1 轉(zhuǎn)基因抗性番茄RNA提取94-96
• 3.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄成為cDNA96
• 3.2.5.3 轉(zhuǎn)基因mRNA的熒光定量PCR檢測96-98
• 3.2.6 PGENE在番茄果實(shí)中表達(dá)蛋白的分析98-101
• 3.2.6.1 抗性番茄果實(shí)總蛋白提取（冰�。�98
• 3.2.6.2 抗性番茄果實(shí)可溶蛋白SDS-PAGE膠 和Western blotting檢測98-99
• 3.2.6.3 可溶性總蛋白濃度測定99-101
• 3.2.7 P粒子電鏡觀察101
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析101-120
• 3.3.1 E8::PGENE載體構(gòu)建101-103
• 3.3.2 大腸桿菌PCR檢測和測序結(jié)果103-104
• 3.3.3 E8::PGENE轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌檢測結(jié)果104-105
• 3.3.4 獲得帶有目的基因的再生番茄陽性株105-106
• 3.3.5 再生番茄抗性篩選106-109
• 3.3.6 陽性植株的Southern blotting分析結(jié)果109-111
• 3.3.7 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量111-114
• 3.3.8 PGENE蛋白在果實(shí)中特異表達(dá)分析114-116
• 3.3.9 轉(zhuǎn)基因抗性番茄果實(shí)可溶性總蛋白濃度的測定116-117
• 3.3.10 轉(zhuǎn)基因抗性番茄果實(shí)特異性蛋白濃度的測定117-119
• 3.3.11 透射電鏡觀察植株表達(dá)P粒子形態(tài)119-120
• 3.4 小結(jié)120-121
• 第四章 番茄果實(shí)動(dòng)物免疫試驗(yàn)121-136
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料121-122
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物121
• 4.1.2 主要試劑121-122
• 4.1.3 主要儀器及耗材122
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法122-128
• 4.2.1 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作及技術(shù)路線122-123
• 4.2.2 免疫原的制備123-124
• 4.2.2.1 原核表達(dá)的蛋白免疫原制備123
• 4.2.2.2 番茄植株表達(dá)的蛋白免疫原制備123-124
• 4.2.3 小鼠抗血清的制備124-125
• 4.2.4 小鼠血清質(zhì)量檢測125-127
• 4.2.4.1 目的蛋白與抗血清最佳反應(yīng)濃度檢測125-127
• 4.2.4.2 血清的效價(jià)檢測127
• 4.2.5 Western Blotting驗(yàn)證免疫功能（特異性）127-128
• 4.3 結(jié)果128-134
• 4.3.1 靶蛋白與抗血清最佳反應(yīng)濃度128
• 4.3.2 抗血清效價(jià)檢測128-130
• 4.3.3 靶蛋白免疫功能驗(yàn)證（特異性）130-134
• 4.3.3.1 pET32a-PGENE表達(dá)的靶蛋白的免疫原性檢測（原核血清vs原核抗原）130-132
• 4.3.3.2 原核表達(dá)蛋白生物學(xué)活性檢測（原核血清vs植株抗原132-133
• 4.3.3.3 植物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的靶蛋白功能檢測 （ 植株免疫血清VS原核和植株抗原和真核抗原）133-134
• 4.4 小結(jié)134-136
• 第五章 討論與展望136-141
• 5.1 討論136-137
• 5.1.1 用大腸桿菌表達(dá)Norovirus亞基疫苗136
• 5.1.2 用番茄表達(dá)Norovirus亞基疫苗136-137
• 5.1.3 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)137
• 5.1.3.1 原核表達(dá)蛋白免疫血清的獲得137
• 5.1.3.2 番茄植株表達(dá)外源蛋白免疫血清的獲得137
• 5.2 結(jié)論137-138
• 5.3 創(chuàng)新點(diǎn)與不足138-139
• 5.3.1 創(chuàng)新點(diǎn)138-139
• 5.3.2 遇到的困難與不足139
• 5.4 后續(xù)工作139-141
• 附錄141-143
• 參考文獻(xiàn)143-157
• 致謝157-159
• 碩士學(xué)位期間已發(fā)表或錄用的專利和論文159

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