本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌O157:H7毒力蛋白NleB1,NleB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸出血性大腸桿菌0157：H7是一種危害嚴(yán)重的腸道致病菌,0157：H7屬于胞外菌,主要利用Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)將毒力蛋白直接注入宿主細(xì)胞內(nèi),通過(guò)影響宿主細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能,如改變細(xì)胞代謝情況、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等,從而達(dá)到侵染宿主的目的。目前,利用生物信息學(xué)的方法分析EHEC O157:H7存在62個(gè)毒力蛋白,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的有39個(gè),其中NleE, NleC,N1eH等毒力蛋白的致病機(jī)制研究的比較透徹,它們分別通過(guò)在不同程度上影響宿主體內(nèi)的NF-κB、MAPK、泛素、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路,從而產(chǎn)生致病性,然而對(duì)于EHEC O157:H7毒力蛋白NleB的研究還處于初始階段,研究其致病機(jī)制對(duì)于探索O157：H7的致病性具有深遠(yuǎn)意義。 腸出血性大腸桿菌EHEC O157:H7的毒力蛋白NleB存在兩個(gè)家族成員：NleB1、NleB2(其中NleB1是經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的毒力蛋白,NleB2未經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證),而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)都是可以轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的。與EHEC親緣關(guān)系相近的腸致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli; EPEC)和檸檬酸桿菌(Citrobacter rodentium)只含有一個(gè)NleB毒力蛋白,C. rodentium的毒力蛋白NleB具有N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性,它可以對(duì)GAPDH進(jìn)行0連接的N乙酰葡糖胺糖基化修飾,從而破壞了GAPDH與TRAF2的相互作用,進(jìn)而抑制了TRAF2的多聚泛素化和NF-κB的活性。 經(jīng)基因序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)腸出血性大腸桿菌EHEC O157:H7的毒力蛋白NleB1與檸檬酸桿菌(Citrobacter rodentium)的NleB堿基序列相似度為89%,這為我們進(jìn)一步探討O157：H7的毒力蛋白NleB1、NleB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的作用及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 利用Real-time PCR方法對(duì)nleB1和nleB2轉(zhuǎn)錄水平評(píng)價(jià)分析,證明了nleB1和nleB2在天然菌株中都可以轉(zhuǎn)錄,且NleB2的表達(dá)量是NleB1的約0.0076倍,差異顯著。 為了進(jìn)一步深入探討EHEC O157:H7毒力蛋白NleB的功能和致病機(jī)制,我們利用λRed重組法構(gòu)建了nleB1, nleB2基因敲除株。毒力評(píng)價(jià)分析得出：敲除株與野生株相比,在LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度無(wú)顯著變化,在DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度要快；基因敲除前后對(duì)HeLa粘附細(xì)胞數(shù)目無(wú)顯著的影響；利用野生株和敲除株侵染HeLα細(xì)胞,用TNF-α刺激,ELISA檢測(cè)IL-8的水平,發(fā)現(xiàn)敲除后IL-8的表達(dá)水平上調(diào)。 通過(guò)構(gòu)建pAcGFP-nleBl, pAcGFP-nleB2,檢測(cè)nleBl, nleB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響,發(fā)現(xiàn)nleBl, nleB2均可以抑制TNF-α激活的NF-κB信號(hào)通路,但是對(duì)IL-1p激活的NF-κB信號(hào)通路無(wú)抑制作用。 本研究構(gòu)建了nleB1, nleB2基因敲除株,并對(duì)其進(jìn)行了初步的毒力評(píng)價(jià)分析,通過(guò)雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)證明了nleB1, nleB2對(duì)TNF-α激活的NF-κB信號(hào)通路有抑制作用,但是對(duì)IL-1β激活的NF-κB信號(hào)通路無(wú)抑制作用。以上實(shí)驗(yàn)為下一步研究NleB1、 NleB2蛋白的功能,以及闡明腸出血性大腸桿菌O157：H7的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：腸出血性大腸桿菌 O157:H7 Ⅲ型分泌系統(tǒng) NleB基因敲除 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R378.21
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 縮略詞表10-12
• 引言12-19
• 第一章 nleB1、nleB2轉(zhuǎn)錄水平的評(píng)價(jià)分析19-23
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)儀器19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 2.1 實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)19
• 2.2 總RNA的提取19-20
• 2.3 cDNA鏈的合成20
• 2.4 實(shí)時(shí)定量PCR20-21
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-22
• 3.1 RNA提取結(jié)果21
• 3.2 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果21-22
• 4 討論22-23
• 第二章 nleB1,nleB2基因敲除株的構(gòu)建23-37
• 1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑23
• 1.2 溶劑配制23
• 1.3 主要的儀器設(shè)備23-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-31
• 2.1 nleB1,nleB2基因敲除引物的設(shè)計(jì)24-25
• 2.2 制備敲除nleB1,nleB2的同源重組片段25-29
• 2.3 EHECO157：H7/pKD46感受態(tài)細(xì)胞的制備29-30
• 2.4 同源重組片段點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化EHEC O157:H7/pKD46感受態(tài)細(xì)胞30
• 2.5 鑒定EHEC O157：H7△nleB1：：kan、EHEC O157：H7△nleB2：：kan菌株30-31
• 3 結(jié)果與分析31-36
• 3.1 基因nleB1上、下游同源臂及Kan片段的制備31-32
• 3.2 基因nleB1同源重組片段的制備32
• 3.3 連接T載體后的酶切獲得同源重組片段32-33
• 3.4 nleB1同源重組片段的大量制備33
• 3.5 鑒定EHEC O157：H7 AnleB1：：Kan菌株33-34
• 3.6 nleB2上、下游同源臂及Kan片段的制備34
• 3.7 nleB2同源重組片段的制備34-35
• 3.8 基因nleB2同源重組片段的大量制備35
• 3.9 鑒定EHEC O157：H7△nleB2：：Kan菌株35-36
• 4 小結(jié)與討論36-37
• 第三章 腸出血性大腸桿菌O157：H7 AnleB1/nleB2毒力評(píng)價(jià)37-44
• 1 實(shí)驗(yàn)材料37-38
• 1.1 主要試劑37
• 1.2 主要溶液配制37
• 1.3 主要儀器37-38
• 2 實(shí)驗(yàn)方法38-40
• 2.1 腸出血性大腸桿菌O157：H7△nleB1和△nleB2在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)38
• 2.2 腸出血性大腸 O157：H7 △nleB1和△nleB2對(duì)粘附細(xì)胞數(shù)目的影響38-39
• 2.3 敲除前后對(duì)IL-8表達(dá)的影響39-40
• 3 結(jié)果40-43
• 3.1 腸出血性大腸桿菌O157：H7△nleB1和△nleB2在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)40-42
• 3.2 腸出血性大腸桿菌O157：H7 △nleB1和△nleB2對(duì)粘附細(xì)胞數(shù)目的影響42
• 3.3 腸出血性大腸桿菌O157：H7野生株、△nleB1和△nleB2對(duì)IL-8表達(dá)的影響42-43
• 4 討論43-44
• 第四章 nleB1,nleB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響44-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料44
• 1.1 實(shí)驗(yàn)試劑44
• 1.2 溶液的配制44
• 1.3 主要的儀器設(shè)備44
• 2 實(shí)驗(yàn)方法44-50
• 2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建策略44-45
• 2.2 PCR擴(kuò)增nleB1,nleB2基因45
• 2.3 pMD19-T-nleB1,pMD19-T-nleB2載體的構(gòu)建45-47
• 2.4 pAcGFP-nleB1,pAcGFP-nleB2載體的構(gòu)建47-49
• 2.5 nleB1,nleB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響49-50
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-52
• 3.1 原核表達(dá)載體pAcGFP-nleB1,pAeGFP-nleB2的構(gòu)建和鑒定50-51
• 3.2 pAcGFP/pAcGFP-nleB1/pAcGFP-nleB2,pNF-KB-luc,pRL-TK轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞51
• 3.3 nleB1,nleB2對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響51-52
• 4 討論52-53
• 全文總結(jié)53-54
• 1 本實(shí)驗(yàn)主要的研究結(jié)果53
• 2 論文的創(chuàng)新點(diǎn)53
• 3 下一步計(jì)劃53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 致謝57-59
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄59

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本文編號(hào)：356512