本文關(guān)鍵詞：副干酪乳酸桿菌X12肽聚糖的提取及誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞免疫原性死亡的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肽聚糖是乳酸桿菌細(xì)胞壁的主要成分，對多種腫瘤具有拮抗作用。目前認(rèn)為，肽聚糖抗腫瘤主要通過免疫調(diào)節(jié)功能實現(xiàn)。免疫原性死亡被認(rèn)為是免疫調(diào)節(jié)類抗腫瘤藥物的關(guān)鍵機制。本研究從前期篩選的具有抗結(jié)腸癌的乳酸菌L.paracasei subp. paracasei X12細(xì)胞壁中提取肽聚糖并在此基礎(chǔ)上探討其對結(jié)腸癌細(xì)胞免疫原性死亡的作用及初步機制。 （1）采用TCA法提取L.paracasei subp. paracasei X12肽聚糖并對其進(jìn)行鑒定及其組分分析。肽聚糖提取率為6.79%；在透射電鏡下觀察，肽聚糖提取物呈囊狀且透明，保留菌體的形態(tài)，具有特征性溶菌酶活性。組成分析表明，肽聚糖提取物中總糖含量為100.86μg/mg，蛋白質(zhì)為0.203μg/mg；氨基酸構(gòu)成分析表明，肽聚糖提取物中富含肽聚糖特有的氨基酸成分，即天冬氨酸（45.54μg/mL）、谷氨酸（54.63μg/mL）、丙氨酸（56.82μg/mL）、賴氨酸（31.27μg/mL）。紫外可見光掃描及SDS凝膠電泳結(jié)果顯示，肽聚糖提取物與肽聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰均在260nm處，分子量范圍在主要14-50KD之間。 （2）肽聚糖能抑制HT-29細(xì)胞增殖。肽聚糖（1600μg/mL）作用細(xì)胞48h，其最大抑制率為24.76%。透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖提取物能誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞染色質(zhì)凝聚、凋亡小體出現(xiàn)等特征性細(xì)胞凋亡的病理改變，并呈劑量-效用關(guān)系。肽聚糖提取物還能以劑量依賴方式損傷HT-29細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)，，出現(xiàn)腫脹、擴張等病理改變。 （3）采用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)，明確了肽聚糖對免疫原性死亡標(biāo)志蛋白—鈣網(wǎng)蛋白的調(diào)控作用。肽聚糖濃度能以劑量依賴和時間依賴方式誘導(dǎo)鈣網(wǎng)蛋白向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，流式細(xì)胞術(shù)證實細(xì)胞膜表面的鈣網(wǎng)蛋白熒光強度顯著增加。肽聚糖提取物能促進(jìn)鈣網(wǎng)蛋白上游因子，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放到細(xì)胞胞漿中，使胞漿中鈣離子濃度顯著升高。隨后研究發(fā)現(xiàn)，肽聚糖提取物能增加鈣網(wǎng)蛋白的下游免疫信號因子IL-8和TNF-α分泌。 綜上，本研究結(jié)果表明，采用改良TCA法能從L.paracasei subp. paracaseiX12提取出完整肽聚糖。該肽聚糖提取物能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡，鈣網(wǎng)蛋白是其關(guān)鍵靶點。
【關(guān)鍵詞】：肽聚糖 細(xì)胞凋亡 免疫原性死亡
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392.1;R735.35
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 緒論10-22
• 1.1 課題研究背景及目的意義10
• 1.2 肽聚糖概述10-15
• 1.2.1 肽聚糖化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2.2 肽聚糖的合成及代謝11-12
• 1.2.3 肽聚糖的分離提取12-13
• 1.2.4 肽聚糖識別分子及其作用13
• 1.2.5 肽聚糖免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用13-15
• 1.3 結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡與免疫調(diào)節(jié)15-17
• 1.4 腫瘤細(xì)胞免疫原性死亡17-20
• 1.4.1 鈣網(wǎng)蛋白與鈣離子18
• 1.4.2 鈣網(wǎng)蛋白膜轉(zhuǎn)位機制18-20
• 1.5 本課題主要研究內(nèi)容20-22
• 1.5.1 技術(shù)路線20-21
• 1.5.2 主要研究內(nèi)容21-22
• 第2章 材料和方法22-34
• 2.1 材料及儀器22-24
• 2.1.1 材料與試劑22-23
• 2.1.2 實驗儀器23-24
• 2.2 肽聚糖提取及其組分分析24-28
• 2.2.1 肽聚糖提取24-25
• 2.2.2 肽聚糖形態(tài)觀察25
• 2.2.3 溶菌酶實驗25
• 2.2.4 總糖含量的測定25-26
• 2.2.5 蛋白質(zhì)含量測定26
• 2.2.6 氨基酸分析26
• 2.2.7 紫外可見光譜掃描分析26-27
• 2.2.8 肽聚糖分子量分析27-28
• 2.3 肽聚糖提取物對結(jié)腸癌抑制作用的研究28-30
• 2.3.1 凍存結(jié)腸癌細(xì)胞復(fù)蘇28
• 2.3.2 結(jié)腸癌細(xì)胞傳代28-29
• 2.3.3 MTT 實驗29
• 2.3.4 HT-29 細(xì)胞凋亡電鏡觀察29-30
• 2.3.5 HT-29 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)電鏡觀察30
• 2.4 肽聚糖誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞免疫原性死亡機制研究30-33
• 2.4.1 免疫細(xì)胞熒光技術(shù)檢測30-31
• 2.4.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面上的鈣網(wǎng)蛋白31
• 2.4.3 細(xì)胞因子 IL-8 檢測31-32
• 2.4.4 腫瘤壞死因子 TNF-α檢測32
• 2.4.5 胞漿中鈣離子濃度測定（流式細(xì)胞術(shù)）32-33
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析33-34
• 第3章 肽聚糖提取及其組分分析34-43
• 3.1 肽聚糖提取及形態(tài)學(xué)觀察34-36
• 3.1.1 肽聚糖提取34-35
• 3.1.2 肽聚糖形態(tài)觀察35-36
• 3.2 肽聚糖提取物組分分析36-39
• 3.2.1 總糖含量測定36
• 3.2.2 蛋白質(zhì)含量測定36-37
• 3.2.3 氨基酸分析37-39
• 3.3 肽聚糖定性研究39-41
• 3.3.1 溶菌酶實驗39-40
• 3.3.2 紫外可見光譜掃描分析40
• 3.3.3 肽聚糖分子量分析40-41
• 3.4 本章小結(jié)41-43
• 第4章 肽聚糖提取物對結(jié)腸癌抑制作用的研究43-50
• 4.1 肽聚糖抑制 HT-29 細(xì)胞增殖研究43-44
• 4.2 肽聚糖誘導(dǎo) HT-29 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察44-47
• 4.3 肽聚糖誘導(dǎo) HT-29 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)觀察47-48
• 4.4 本章小結(jié)48-50
• 第5章 肽聚糖誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞免疫原性死亡的機制研究50-62
• 5.1 肽聚糖誘導(dǎo) HT-29 細(xì)胞鈣網(wǎng)蛋白膜轉(zhuǎn)位作用50-54
• 5.1.1 免疫細(xì)胞熒光技術(shù)檢測50-52
• 5.1.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面上的鈣網(wǎng)蛋白52-54
• 5.2 肽聚糖對細(xì)胞因子的影響54-58
• 5.2.1 細(xì)胞因子 IL-8 檢測54-56
• 5.2.2 腫瘤壞死因子 TNF-α檢測56-58
• 5.3 細(xì)胞胞漿中鈣離子濃度研究58-60
• 5.4 本章小結(jié)60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文70-72
• 致謝72

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本文編號：356335