發(fā)布時間：2017-05-11 05:15

  本文關鍵詞：FGFR2介導的人骨髓間充質干細胞成骨與成脂分化的調控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及意義 成纖維細胞生長因子及其受體(fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors, FGFs/FGFRs)是骨發(fā)育和脂肪代謝中一類重要的信號分子,FGFR2在骨骼發(fā)育中的作用尤其受到關注。成骨細胞和脂肪細胞都可以由骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)分化而來,然而目前對于FGFR2在hBMSCs的定向分化過程中發(fā)揮的作用研究甚少。FGFR2異構體FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc的選擇性剪接受多聚嘧啶束結合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)調控,有文獻報道PTB參與胚胎發(fā)育過程中三胚層的形成以及外胚層成腔作用,但其是否影響hBMSCs的定向分化尚無報道。此外,hBMSCs定向分化誘導液中不同濃度的地塞米松(dexamethasone, DEX)影響hBMSCs成骨與成脂標志基因的表達,但其作用是否與FGFR2的表達有相關性并不清楚。通過探討FGFR2可能介導的與hBMSCs成骨和成脂分化相關的調控,有助于深入了解hBMSCs的定向分化機制。 目的 1、明確]hBMSCs成骨和成脂分化過程中FGF1、FGF2、FGF10、FGF18及其受體FGFR1、 FGFR2Ⅲb/Ⅲc、FGFR3Ⅲb/IIIc、FGFR4的動態(tài)表達和相關信號通路,探討外源性加入FGFR2的配體FGF1后對hBMSCs分化的影響。 2、明確PTB對hBMSCs成骨與成脂分化、以及分化過程中FGFR2Ⅲb/Ⅲc表達的影響,探討PTB與hBMSCs定向分化之間的關系。 3、明確不同濃度DEX對hBMSCs成骨與成脂分化標志基因、以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc表達的影響,探討DEX對hBMSCs定向分化的作用。 方法 1、取人骨髓血,采用密度梯度離心法分離hBMSCs,貼壁培養(yǎng)并傳代純化,取第三代細胞分別用流式細胞術檢測、成骨與脂肪誘導分化并染色進行間充質干細胞鑒定。 2、第三代hBMSCs體外進行成骨和成脂誘導分化,應用Real-time PCR檢測誘導分化不同時間點FGFs和FGFRs mRNA表達水平,應用免疫熒光檢測誘導前后細胞中FGF1、 FGF2的蛋白表達并進行細胞定位。Western blot檢測成骨分化過程中pERKl/2的表達變化。 3、在成骨和成脂誘導液中分別加入不同濃度外源FGF1誘導hBMSCs3天和7天,應用Real-time PCR檢測成骨與成脂標志基因的表達,并用油紅O染色鑒定成脂分化效果。 4、采用RT PCR和Western blot檢測hBMSCs成骨和成脂分化過程中PTB的表達,采用Knock down技術抑制hBMSCs中PTB基因表達,并進行成骨誘導,檢測成骨標志基因ALP、RUNX2與成脂標志基因。PPARγ以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表達。 5、在]BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基中加入不同濃度的DEX, Real-time PCR檢測成骨和成脂標志基因以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表達。 結果 1、hBMSCs的生物學特性鑒定：第三代hBMSCs表達CD90和CD105等間充質干細胞表面標志,不表達CD29和CD44等造血干細胞表面標志物。hBMSCs在體外可被誘導分化為成骨細胞與脂肪細胞,茜素紅與油紅O染色均為陽性,成骨與成脂相關標志基因表達上調。 2、FGFs/FGFRs在BMSCs定向分化中呈現(xiàn)動態(tài)表達,其中FGFR2Ⅲb與FGFR2Ⅲc在hBMSCs成骨與成脂過程中表達先上升后下降；FGFR2配體FGF1能夠抑制脂滴的形成以及PPARy、C/EBPa的表達(p0.01)而促進骨橋蛋白(OPN)表達增加(p0.05)。 3、在hBMSCs成骨分化過程中,PTB表達升高；hBMSCs Knock down PTB后成骨誘導過程中成骨標志基因RUNX2和ALP (p0.05)的表達被抑制；而成脂標志基因PPARγ表達升高(p0.05)；并且FGFR2Ⅲb與FGFR2ⅢC表達也受到抑制(p0.05)。 4、隨著培養(yǎng)液中DEX濃度升高,hBMSCs增殖速度降低,形成脂滴的能力增加；高濃度組hBMSCs中成脂標志基因PPARγ、C/EBPα表達較高,低濃度組成骨標志基因RUNX2和ALP表達較高。FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc在10-6mol/L濃度中表達增強,10-8mol/L濃度中表達被抑制。 結論 采用密度梯度離心及貼壁篩選法連續(xù)傳代純化細胞可成功分離hBMSCs;FGFs/FGFRs在hBMSCs成骨與成脂分化過程中呈現(xiàn)特定趨勢的動態(tài)表達,FGFR2與hBMSCs分化密切相關；PTB對hBMSCs成骨分化的調節(jié)可能由FGFR2介導；不同濃度DEX能夠影響hBMSCs的增殖速率和成骨、成脂分化標志基因的表達,高濃度DEX對hBMSCs定向分化的作用可能由FGFR2來介導。
【關鍵詞】：人骨髓間充質干細胞 成骨分化 成脂分化 成纖維細胞生長因子 成纖維細胞生長因子受體 多聚嘧啶束結合蛋白 地塞米松
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 第一章 hBMSCs的分離培養(yǎng)與生物學特性鑒定11-23
• 前言11-12
• 1 實驗材料12-14
• 2 實驗方法14-18
• 3 實驗結果18-21
• 4 討論21-22
• 5 小結22-23
• 第二章 hBMSCs成骨與成脂分化過程中FGFs/FGFRs通路研究23-40
• 第一節(jié) hBMSCs定向分化過程中FGFs/FGFRs的動態(tài)表達23-35
• 0 前言23-24
• 1 材料24-26
• 2 實驗方法26-27
• 3 實驗結果27-31
• 4 討論31-34
• 5 小結34-35
• 第二節(jié) 外源性FGF1對hBMSCs定向分化的影響35-40
• 0 前言35
• 1 實驗材料35-36
• 2 實驗方法36-37
• 3 實驗結果37-39
• 4 討論39
• 5 小結39-40
• 第三章 PTB對hBMSCs定向分化及FGFR2表達的影響40-51
• 0 前言40-41
• 1 實驗材料41-43
• 2 實驗方法43-46
• 3 實驗結果46-49
• 4 討論49-50
• 5 小結50-51
• 第四章 不同濃度地塞米松對hBMSCs定向分化及FGFR2表達的影響51-59
• 0 前言51-52
• 1 實驗材料52
• 2 實驗方法52-53
• 3 實驗結果53-57
• 4 討論57-58
• 5 小結58-59
• 全文總結59-60
• 參考文獻60-66
• 論文綜述：成纖維細胞生長因子研究進展66-73
• 參考文獻70-73
• 英文縮略詞表73-74
• 致謝74-75
• 發(fā)表論文75-76

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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  本文關鍵詞：FGFR2介導的人骨髓間充質干細胞成骨與成脂分化的調控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：356358