發(fā)布時間：2017-05-11 05:15

  本文關(guān)鍵詞：FGFR2介導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂分化的調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及意義 成纖維細(xì)胞生長因子及其受體(fibroblast growth factors/fibroblast growth factor receptors, FGFs/FGFRs)是骨發(fā)育和脂肪代謝中一類重要的信號分子,FGFR2在骨骼發(fā)育中的作用尤其受到關(guān)注。成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞都可以由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)分化而來,然而目前對于FGFR2在hBMSCs的定向分化過程中發(fā)揮的作用研究甚少。FGFR2異構(gòu)體FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc的選擇性剪接受多聚嘧啶束結(jié)合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)調(diào)控,有文獻(xiàn)報道PTB參與胚胎發(fā)育過程中三胚層的形成以及外胚層成腔作用,但其是否影響hBMSCs的定向分化尚無報道。此外,hBMSCs定向分化誘導(dǎo)液中不同濃度的地塞米松(dexamethasone, DEX)影響hBMSCs成骨與成脂標(biāo)志基因的表達(dá),但其作用是否與FGFR2的表達(dá)有相關(guān)性并不清楚。通過探討FGFR2可能介導(dǎo)的與hBMSCs成骨和成脂分化相關(guān)的調(diào)控,有助于深入了解hBMSCs的定向分化機(jī)制。 目的 1、明確]hBMSCs成骨和成脂分化過程中FGF1、FGF2、FGF10、FGF18及其受體FGFR1、 FGFR2Ⅲb/Ⅲc、FGFR3Ⅲb/IIIc、FGFR4的動態(tài)表達(dá)和相關(guān)信號通路,探討外源性加入FGFR2的配體FGF1后對hBMSCs分化的影響。 2、明確PTB對hBMSCs成骨與成脂分化、以及分化過程中FGFR2Ⅲb/Ⅲc表達(dá)的影響,探討PTB與hBMSCs定向分化之間的關(guān)系。 3、明確不同濃度DEX對hBMSCs成骨與成脂分化標(biāo)志基因、以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc表達(dá)的影響,探討DEX對hBMSCs定向分化的作用。 方法 1、取人骨髓血,采用密度梯度離心法分離hBMSCs,貼壁培養(yǎng)并傳代純化,取第三代細(xì)胞分別用流式細(xì)胞術(shù)檢測、成骨與脂肪誘導(dǎo)分化并染色進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定。 2、第三代hBMSCs體外進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)分化,應(yīng)用Real-time PCR檢測誘導(dǎo)分化不同時間點(diǎn)FGFs和FGFRs mRNA表達(dá)水平,應(yīng)用免疫熒光檢測誘導(dǎo)前后細(xì)胞中FGF1、 FGF2的蛋白表達(dá)并進(jìn)行細(xì)胞定位。Western blot檢測成骨分化過程中pERKl/2的表達(dá)變化。 3、在成骨和成脂誘導(dǎo)液中分別加入不同濃度外源FGF1誘導(dǎo)hBMSCs3天和7天,應(yīng)用Real-time PCR檢測成骨與成脂標(biāo)志基因的表達(dá),并用油紅O染色鑒定成脂分化效果。 4、采用RT PCR和Western blot檢測hBMSCs成骨和成脂分化過程中PTB的表達(dá),采用Knock down技術(shù)抑制hBMSCs中PTB基因表達(dá),并進(jìn)行成骨誘導(dǎo),檢測成骨標(biāo)志基因ALP、RUNX2與成脂標(biāo)志基因。PPARγ以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表達(dá)。 5、在]BMSCs常規(guī)培養(yǎng)基中加入不同濃度的DEX, Real-time PCR檢測成骨和成脂標(biāo)志基因以及FGFR2Ⅲb/Ⅲc的表達(dá)。 結(jié)果 1、hBMSCs的生物學(xué)特性鑒定：第三代hBMSCs表達(dá)CD90和CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志,不表達(dá)CD29和CD44等造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物。hBMSCs在體外可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞,茜素紅與油紅O染色均為陽性,成骨與成脂相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)上調(diào)。 2、FGFs/FGFRs在BMSCs定向分化中呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá),其中FGFR2Ⅲb與FGFR2Ⅲc在hBMSCs成骨與成脂過程中表達(dá)先上升后下降；FGFR2配體FGF1能夠抑制脂滴的形成以及PPARy、C/EBPa的表達(dá)(p0.01)而促進(jìn)骨橋蛋白(OPN)表達(dá)增加(p0.05)。 3、在hBMSCs成骨分化過程中,PTB表達(dá)升高；hBMSCs Knock down PTB后成骨誘導(dǎo)過程中成骨標(biāo)志基因RUNX2和ALP (p0.05)的表達(dá)被抑制；而成脂標(biāo)志基因PPARγ表達(dá)升高(p0.05)；并且FGFR2Ⅲb與FGFR2ⅢC表達(dá)也受到抑制(p0.05)。 4、隨著培養(yǎng)液中DEX濃度升高,hBMSCs增殖速度降低,形成脂滴的能力增加；高濃度組hBMSCs中成脂標(biāo)志基因PPARγ、C/EBPα表達(dá)較高,低濃度組成骨標(biāo)志基因RUNX2和ALP表達(dá)較高。FGFR2Ⅲb和FGFR2Ⅲc在10-6mol/L濃度中表達(dá)增強(qiáng),10-8mol/L濃度中表達(dá)被抑制。 結(jié)論 采用密度梯度離心及貼壁篩選法連續(xù)傳代純化細(xì)胞可成功分離hBMSCs;FGFs/FGFRs在hBMSCs成骨與成脂分化過程中呈現(xiàn)特定趨勢的動態(tài)表達(dá),FGFR2與hBMSCs分化密切相關(guān)；PTB對hBMSCs成骨分化的調(diào)節(jié)可能由FGFR2介導(dǎo)；不同濃度DEX能夠影響hBMSCs的增殖速率和成骨、成脂分化標(biāo)志基因的表達(dá),高濃度DEX對hBMSCs定向分化的作用可能由FGFR2來介導(dǎo)。
【關(guān)鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 成脂分化 成纖維細(xì)胞生長因子 成纖維細(xì)胞生長因子受體 多聚嘧啶束結(jié)合蛋白 地塞米松
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-11
• 第一章 hBMSCs的分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性鑒定11-23
• 前言11-12
• 1 實驗材料12-14
• 2 實驗方法14-18
• 3 實驗結(jié)果18-21
• 4 討論21-22
• 5 小結(jié)22-23
• 第二章 hBMSCs成骨與成脂分化過程中FGFs/FGFRs通路研究23-40
• 第一節(jié) hBMSCs定向分化過程中FGFs/FGFRs的動態(tài)表達(dá)23-35
• 0 前言23-24
• 1 材料24-26
• 2 實驗方法26-27
• 3 實驗結(jié)果27-31
• 4 討論31-34
• 5 小結(jié)34-35
• 第二節(jié) 外源性FGF1對hBMSCs定向分化的影響35-40
• 0 前言35
• 1 實驗材料35-36
• 2 實驗方法36-37
• 3 實驗結(jié)果37-39
• 4 討論39
• 5 小結(jié)39-40
• 第三章 PTB對hBMSCs定向分化及FGFR2表達(dá)的影響40-51
• 0 前言40-41
• 1 實驗材料41-43
• 2 實驗方法43-46
• 3 實驗結(jié)果46-49
• 4 討論49-50
• 5 小結(jié)50-51
• 第四章 不同濃度地塞米松對hBMSCs定向分化及FGFR2表達(dá)的影響51-59
• 0 前言51-52
• 1 實驗材料52
• 2 實驗方法52-53
• 3 實驗結(jié)果53-57
• 4 討論57-58
• 5 小結(jié)58-59
• 全文總結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 論文綜述：成纖維細(xì)胞生長因子研究進(jìn)展66-73
• 參考文獻(xiàn)70-73
• 英文縮略詞表73-74
• 致謝74-75
• 發(fā)表論文75-76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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  本文關(guān)鍵詞：FGFR2介導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂分化的調(diào)控機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：356358