發(fā)布時間：2017-05-11 05:00

  本文關(guān)鍵詞：人溶血磷脂酸受體3基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及其功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：克隆人質(zhì)子感知受體LPAR3基因、構(gòu)建LPAR3基因的表達(dá)載體并瞬時轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞,檢測LPAR3的表達(dá)及研究其對細(xì)胞遷移的作用。 方法：設(shè)計一對針對LPA3基因的引物,從含有人LPAR3序列的質(zhì)粒中克隆不含終止密碼子的LPAR3基因并亞克隆至pMD19-T載體。將鑒定出的陽性質(zhì)粒和表達(dá)載體pIRES2-EGFP用XhoI酶和BamH I酶雙酶切回收后連接獲得陽性重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPA3,并測序鑒定；重組載體以Lipofectamine LTXPlux Reagent介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞(293T細(xì)胞)。用Real time PCR去檢測外源基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)。隨后將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞HO-8910中,用Real time PCI法檢測LPAR3在野生型細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中LPAR3基因表達(dá)量,同時檢測在LPA刺激下的兩種細(xì)胞的增殖情況。 結(jié)果：測序和酶切證實了克隆到：LPAR3基因并獲得了pIRES2-EGFP-LPAR3表達(dá)載體；熒光顯微鏡照相與Real time PCR都證實了LPAR3基因在293T細(xì)胞當(dāng)中的高表達(dá)；同時定量檢測還發(fā)現(xiàn)LPAR3基因在人卵巢癌細(xì)胞(HO-8910細(xì)胞)中高表達(dá)。LPA梯度刺激HO-8910細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),LPA可以抑制細(xì)胞的增殖效應(yīng),同時LPA刺激LPAR3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力下降。 結(jié)論：基因克隆構(gòu)建得到]LPAR3基因和表達(dá)載體pIRES2-EGFP-LPAR3,轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測到LPAR3在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá),同時還發(fā)現(xiàn)LPA刺激可以抑制HO-8910細(xì)胞的增殖,且轉(zhuǎn)染LPAR3基因后LPA抑制細(xì)胞增殖的作用增強。
【關(guān)鍵詞】：LPA3受體 HO-8910細(xì)胞 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：Q78;R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 英文縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 第一章 人溶血磷脂酸受體3(LPAR3)基因的克隆及克隆載體的構(gòu)建14-25
• 1.1 實驗材料14-16
• 1.1.1 主要試劑14
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備14-15
• 1.1.3 菌種15
• 1.1.4 常用溶液的配制15-16
• 1.2 方法16-22
• 1.2.1 引物的設(shè)計16
• 1.2.2 模板cDNA的制備16-18
• 1.2.3 PCR擴增及膠回收18-19
• 1.2.4 pMD19-T-LPAR3的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和鑒定19-21
• 1.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T-LPAR3的測序鑒定21-22
• 1.3 結(jié)果22-23
• 1.3.1 人溶血磷脂酸受體3(LPAR3)基因的PCR擴增22
• 1.3.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-LPA3的PCR鑒定22-23
• 1.3.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-LPAR3的雙酶切鑒定23
• 1.3.4 重組質(zhì)粒pMD19-T-LPAR3的測序鑒定23
• 1.4 討論23-25
• 第二章 人溶血磷脂酸受體(LPAR3)基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建25-31
• 2.1 實驗材料25-26
• 2.1.1 主要試劑25
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備25
• 2.1.3 菌種25-26
• 2.1.4 質(zhì)粒26
• 2.1.5 常用溶液的配制26
• 2.2 方法26-28
• 2.2.1 表達(dá)載體pIRES2-EGFP的Xho I、BamH I雙酶切及膠回收26-27
• 2.2.2 重組載體pMD19-T-LPAR3的Xho I、BamH I酶切處理及膠回收27
• 2.2.3 重組載體pMD19-T-LPAR3和表達(dá)載體pIRES2-EGFP雙酶切產(chǎn)物的連接27-28
• 2.2.4 重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-LPAR3雙酶切鑒定28
• 2.2.5 重組表達(dá)載體plRES2-EGFP-LPAR3的測序鑒定28
• 2.3 結(jié)果28-30
• 2.3.1 表達(dá)載體pIRES2-EGFP的Xho I及BamH I雙雙酶切28-29
• 2.3.2 重組載體pMD-19T-LPAR3的Xho I和BamH I雙酶切29
• 2.3.3 重組表達(dá)載體pIRES2-EGFP-LPAR3雙酶切鑒定29-30
• 2.3.4 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPAR3的測序鑒定30
• 2.4 討論30-31
• 第三章 Real Time PCR和顯微熒光檢測pIRES2-EGFP-LPAR3轉(zhuǎn)染與未傳染293T細(xì)胞的表達(dá)差異31-42
• 3.1 實驗材料31-32
• 3.1.1 主要試劑31
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備31-32
• 3.1.3 細(xì)胞株及質(zhì)粒32
• 3.1.4 常用溶液的配制32
• 3.2 方法32-39
• 3.2.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng)32-34
• 3.2.2 pIRES2-EGFP空載體質(zhì)粒及重組pIRES2-EGFP-LPAR3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞34-36
• 3.2.3 pIRES2-EGFP空載體質(zhì)粒及重組pIRES2-EGFP-LPAR3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞顯微熒光照相36
• 3.2.4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞Total RNA提取36-38
• 3.2.5 Real Time PCR檢測轉(zhuǎn)染效果38-39
• 3.3 結(jié)果39-41
• 3.3.1 顯微熒光照相39-40
• 3.3.2 Real Time PCR相對定量結(jié)果40-41
• 3.4 討論41-42
• 第四章 在卵巢癌細(xì)胞中LPA通過LPAR3誘導(dǎo)HO-8910卵巢癌細(xì)胞增殖功能檢測42-55
• 4.1 實驗材料42-43
• 4.1.1 主要試劑與耗材42
• 4.1.2 主要儀器42-43
• 4.1.3 細(xì)胞株及質(zhì)粒43
• 4.1.4 溶液配制43
• 4.2 方法43-48
• 4.2.1 HO-8910細(xì)胞的培養(yǎng)43-44
• 4.2.2 Real Time PCR檢測HO-8910卵巢癌細(xì)胞LPAR1-6基礎(chǔ)表達(dá)44-45
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞LPAR3 mRNA表達(dá)水平檢測45
• 4.2.4 MTT細(xì)胞數(shù)目標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作45-46
• 4.2.5 LPA梯度刺激HO-8910細(xì)胞增殖檢測46
• 4.2.6 Ki16425預(yù)處理細(xì)胞增殖檢測46-47
• 4.2.7 LPAR3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞LPA刺激細(xì)胞增殖檢測47-48
• 4.3 結(jié)果48-53
• 4.3.1 定量檢測HO-8910卵巢癌細(xì)胞中LPAR1-6基因的表達(dá)48-49
• 4.3.2 顯微熒光照相49-50
• 4.3.3 定量檢測轉(zhuǎn)染LPAR3轉(zhuǎn)基因后HO-8910卵巢癌細(xì)胞LPAR3基因的表達(dá)50-51
• 4.3.4 HO-8910細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)曲線51-52
• 4.3.5 LPA梯度刺激HO-8910細(xì)胞增殖檢測52
• 4.3.6 Ki16425預(yù)處理后細(xì)胞跟正常未處理細(xì)胞增殖檢測52-53
• 4.3.7 LPAR3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞LPA誘導(dǎo)下細(xì)胞增殖檢測53
• 4.4 討論53-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-58
• 文獻(xiàn)綜述58-65
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 附錄65-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文69

【共引文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 馮勇;溶血磷脂酸受體在人食管下括約肌的表達(dá)及功能研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

2 烏云格日樂;溶血磷脂酸受體在LPA誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞BGC-803遷移中的作用[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2014年

  本文關(guān)鍵詞：人溶血磷脂酸受體3基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及其功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：356260