發(fā)布時間：2017-05-11 05:00

  本文關鍵詞：人溶血磷脂酸受體3基因的克隆、表達載體構建及其功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：克隆人質子感知受體LPAR3基因、構建LPAR3基因的表達載體并瞬時轉染HO-8910細胞,檢測LPAR3的表達及研究其對細胞遷移的作用。 方法：設計一對針對LPA3基因的引物,從含有人LPAR3序列的質粒中克隆不含終止密碼子的LPAR3基因并亞克隆至pMD19-T載體。將鑒定出的陽性質粒和表達載體pIRES2-EGFP用XhoI酶和BamH I酶雙酶切回收后連接獲得陽性重組質粒pIRES2-EGFP-LPA3,并測序鑒定；重組載體以Lipofectamine LTXPlux Reagent介導轉染人腎上皮細胞(293T細胞)。用Real time PCR去檢測外源基因在293T細胞中的表達。隨后將其轉染至卵巢癌細胞HO-8910中,用Real time PCI法檢測LPAR3在野生型細胞與轉基因細胞中LPAR3基因表達量,同時檢測在LPA刺激下的兩種細胞的增殖情況。 結果：測序和酶切證實了克隆到：LPAR3基因并獲得了pIRES2-EGFP-LPAR3表達載體；熒光顯微鏡照相與Real time PCR都證實了LPAR3基因在293T細胞當中的高表達；同時定量檢測還發(fā)現(xiàn)LPAR3基因在人卵巢癌細胞(HO-8910細胞)中高表達。LPA梯度刺激HO-8910細胞后發(fā)現(xiàn),LPA可以抑制細胞的增殖效應,同時LPA刺激LPAR3轉基因細胞相比未轉染細胞增殖能力下降。 結論：基因克隆構建得到]LPAR3基因和表達載體pIRES2-EGFP-LPAR3,轉染細胞檢測到LPAR3在細胞內高表達,同時還發(fā)現(xiàn)LPA刺激可以抑制HO-8910細胞的增殖,且轉染LPAR3基因后LPA抑制細胞增殖的作用增強。
【關鍵詞】：LPA3受體 HO-8910細胞 細胞增殖
【學位授予單位】：內蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q78;R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 英文縮略詞表10-12
• 前言12-14
• 第一章 人溶血磷脂酸受體3(LPAR3)基因的克隆及克隆載體的構建14-25
• 1.1 實驗材料14-16
• 1.1.1 主要試劑14
• 1.1.2 主要儀器設備14-15
• 1.1.3 菌種15
• 1.1.4 常用溶液的配制15-16
• 1.2 方法16-22
• 1.2.1 引物的設計16
• 1.2.2 模板cDNA的制備16-18
• 1.2.3 PCR擴增及膠回收18-19
• 1.2.4 pMD19-T-LPAR3的構建、轉化和鑒定19-21
• 1.2.5 重組質粒pMD19-T-LPAR3的測序鑒定21-22
• 1.3 結果22-23
• 1.3.1 人溶血磷脂酸受體3(LPAR3)基因的PCR擴增22
• 1.3.2 重組質粒pMD19-T-LPA3的PCR鑒定22-23
• 1.3.3 重組質粒pMD19-T-LPAR3的雙酶切鑒定23
• 1.3.4 重組質粒pMD19-T-LPAR3的測序鑒定23
• 1.4 討論23-25
• 第二章 人溶血磷脂酸受體(LPAR3)基因真核表達載體的構建25-31
• 2.1 實驗材料25-26
• 2.1.1 主要試劑25
• 2.1.2 主要儀器設備25
• 2.1.3 菌種25-26
• 2.1.4 質粒26
• 2.1.5 常用溶液的配制26
• 2.2 方法26-28
• 2.2.1 表達載體pIRES2-EGFP的Xho I、BamH I雙酶切及膠回收26-27
• 2.2.2 重組載體pMD19-T-LPAR3的Xho I、BamH I酶切處理及膠回收27
• 2.2.3 重組載體pMD19-T-LPAR3和表達載體pIRES2-EGFP雙酶切產(chǎn)物的連接27-28
• 2.2.4 重組表達載體pIRES2-EGFP-LPAR3雙酶切鑒定28
• 2.2.5 重組表達載體plRES2-EGFP-LPAR3的測序鑒定28
• 2.3 結果28-30
• 2.3.1 表達載體pIRES2-EGFP的Xho I及BamH I雙雙酶切28-29
• 2.3.2 重組載體pMD-19T-LPAR3的Xho I和BamH I雙酶切29
• 2.3.3 重組表達載體pIRES2-EGFP-LPAR3雙酶切鑒定29-30
• 2.3.4 重組質粒pIRES2-EGFP-LPAR3的測序鑒定30
• 2.4 討論30-31
• 第三章 Real Time PCR和顯微熒光檢測pIRES2-EGFP-LPAR3轉染與未傳染293T細胞的表達差異31-42
• 3.1 實驗材料31-32
• 3.1.1 主要試劑31
• 3.1.2 主要儀器設備31-32
• 3.1.3 細胞株及質粒32
• 3.1.4 常用溶液的配制32
• 3.2 方法32-39
• 3.2.1 293T細胞的培養(yǎng)32-34
• 3.2.2 pIRES2-EGFP空載體質粒及重組pIRES2-EGFP-LPAR3質粒轉染293T細胞34-36
• 3.2.3 pIRES2-EGFP空載體質粒及重組pIRES2-EGFP-LPAR3質粒轉染293T細胞顯微熒光照相36
• 3.2.4 轉基因細胞Total RNA提取36-38
• 3.2.5 Real Time PCR檢測轉染效果38-39
• 3.3 結果39-41
• 3.3.1 顯微熒光照相39-40
• 3.3.2 Real Time PCR相對定量結果40-41
• 3.4 討論41-42
• 第四章 在卵巢癌細胞中LPA通過LPAR3誘導HO-8910卵巢癌細胞增殖功能檢測42-55
• 4.1 實驗材料42-43
• 4.1.1 主要試劑與耗材42
• 4.1.2 主要儀器42-43
• 4.1.3 細胞株及質粒43
• 4.1.4 溶液配制43
• 4.2 方法43-48
• 4.2.1 HO-8910細胞的培養(yǎng)43-44
• 4.2.2 Real Time PCR檢測HO-8910卵巢癌細胞LPAR1-6基礎表達44-45
• 4.2.3 轉基因細胞LPAR3 mRNA表達水平檢測45
• 4.2.4 MTT細胞數(shù)目標準曲線的制作45-46
• 4.2.5 LPA梯度刺激HO-8910細胞增殖檢測46
• 4.2.6 Ki16425預處理細胞增殖檢測46-47
• 4.2.7 LPAR3轉基因細胞LPA刺激細胞增殖檢測47-48
• 4.3 結果48-53
• 4.3.1 定量檢測HO-8910卵巢癌細胞中LPAR1-6基因的表達48-49
• 4.3.2 顯微熒光照相49-50
• 4.3.3 定量檢測轉染LPAR3轉基因后HO-8910卵巢癌細胞LPAR3基因的表達50-51
• 4.3.4 HO-8910細胞的標準曲線51-52
• 4.3.5 LPA梯度刺激HO-8910細胞增殖檢測52
• 4.3.6 Ki16425預處理后細胞跟正常未處理細胞增殖檢測52-53
• 4.3.7 LPAR3轉基因細胞LPA誘導下細胞增殖檢測53
• 4.4 討論53-55
• 致謝55-56
• 參考文獻56-58
• 文獻綜述58-65
• 參考文獻63-65
• 附錄65-69
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文69

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 馮勇;溶血磷脂酸受體在人食管下括約肌的表達及功能研究[D];河北醫(yī)科大學;2014年

2 烏云格日樂;溶血磷脂酸受體在LPA誘導的胃癌細胞BGC-803遷移中的作用[D];內蒙古大學;2014年

  本文關鍵詞：人溶血磷脂酸受體3基因的克隆、表達載體構建及其功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：356260