本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE的結(jié)構(gòu)和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)與宿主感染密切相關(guān)，其中SdrE蛋白質(zhì)為金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)主要成員之一，在骨骼等感染中起重要作用，且在人等宿主中無同源蛋白質(zhì)。因此，希望通過對金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE進(jìn)行克隆表達(dá)純化及晶體培養(yǎng)，以期解析其三維結(jié)構(gòu)；并通過基因敲除和定點突變，以及相應(yīng)的功能實驗，深入分析金黃色葡萄球菌感染的分子機(jī)制，，為研發(fā)新型特異性抗金黃色葡萄球菌藥物提供理論基礎(chǔ)。 方法利用PCR技術(shù)擴(kuò)增SdrE基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pW28-SdrE，并在大腸桿菌（Escherichia coli, E.coli）B834中表達(dá)SdrE母體蛋白質(zhì)和硒代蛋白質(zhì)，通過Ni2+-NTA親和層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化目的蛋白質(zhì)，再用Hiload Superdex200凝膠層析柱分析其在溶液中的聚集狀態(tài)，用Hampton試劑盒初篩晶體及棋盤法優(yōu)化晶體。運(yùn)用X-ray衍射儀收集衍射數(shù)據(jù)，解析其三維結(jié)構(gòu)。運(yùn)用重疊延伸PCR和等位替換原理進(jìn)行基因敲除和定點突變，在此基礎(chǔ)上通過藥敏試驗了解SdrE與金黃色葡萄球菌耐藥性的關(guān)系；Pull-down、SPR、ITC等生化實驗驗證SdrE與蛋白質(zhì)相互作用位點；粘附和侵襲等細(xì)胞實驗分析SdrE與金黃色葡萄球菌感染的關(guān)系；小鼠等實驗動物研究進(jìn)一步分析SdrE與金黃色葡萄球菌毒力的關(guān)系。 結(jié)果構(gòu)建了融合質(zhì)粒pW28-SdrE，并在E.coli B834中可溶性表達(dá)。獲得了純度較高(95%)的SdrE母體蛋白質(zhì)，該蛋白在溶液中以單體形式存在；同時表達(dá)純化出純度約為85%的SdrE硒代蛋白質(zhì)。獲得了SdrE母體蛋白質(zhì)單晶和硒代蛋白質(zhì)單晶，并在上海光源實驗室收集到兩套高分辨率的衍射數(shù)據(jù)。SdrE蛋白質(zhì)晶體屬于P222空間群，晶胞參數(shù)為a=45.19，b=66.35，c=146.22，其中，每一個晶體學(xué)不對稱單位包含1個蛋白質(zhì)分子，相應(yīng)的結(jié)構(gòu)解析工作正在進(jìn)行。成功的構(gòu)建了金黃色葡萄球菌SdrE基因缺失菌株，并通過細(xì)胞實驗表明SdrE與金黃色葡萄球菌的侵襲能力密切相關(guān)。 結(jié)論利用經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化技術(shù)和晶體培養(yǎng)技術(shù)，獲得衍射能力較強(qiáng)的蛋白質(zhì)單晶，其三維結(jié)構(gòu)的解析正在進(jìn)行，通過基因敲除和細(xì)胞實驗驗證了SdrE與金黃色葡萄球菌感染相關(guān)，為基于結(jié)構(gòu)的新型特異性抗菌藥物的研發(fā)提供了重要的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：金黃色葡萄球菌 表面蛋白質(zhì)SdrE 蛋白質(zhì)晶體 基因敲除 抗菌藥物
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-15
• 參考文獻(xiàn)13-15
• 第一章 金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE的結(jié)構(gòu)研究15-42
• 第一節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE的克隆、表達(dá)及純化16-35
• 1 材料與方法16-28
• 2 結(jié)果28-34
• 3 討論34-35
• 第二節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE的三維結(jié)構(gòu)分析35-40
• 1 材料與方法35-37
• 2 結(jié)果37-40
• 3 討論40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 第二章 金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE的功能研究42-63
• 第一節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SdrE的基因敲除43-57
• 1 材料和方法43-51
• 2 結(jié)果51-56
• 3 討論56-57
• 第二節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì) SdrE 的毒力分析57-61
• 1 材料和方法57-59
• 2 結(jié)果59-60
• 3 討論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 全文總結(jié)63-64
• 文獻(xiàn)綜述64-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 致謝72-73
• 發(fā)表的論文、參加的學(xué)術(shù)會議及參與的科研項目73-75

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林亞靜;劉志杰;龔為民;;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究[J];生命科學(xué);2007年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 牛司強(qiáng);一種肺炎鏈球菌溶菌酶樣假想蛋白質(zhì)SP0987的結(jié)構(gòu)和功能研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

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本文編號：356030