本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的結構和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的金黃色葡萄球菌表面蛋白質與宿主感染密切相關，其中SdrE蛋白質為金黃色葡萄球菌表面蛋白質主要成員之一，在骨骼等感染中起重要作用，且在人等宿主中無同源蛋白質。因此，希望通過對金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE進行克隆表達純化及晶體培養(yǎng)，以期解析其三維結構；并通過基因敲除和定點突變，以及相應的功能實驗，深入分析金黃色葡萄球菌感染的分子機制，，為研發(fā)新型特異性抗金黃色葡萄球菌藥物提供理論基礎。 方法利用PCR技術擴增SdrE基因，構建重組質粒pW28-SdrE，并在大腸桿菌（Escherichia coli, E.coli）B834中表達SdrE母體蛋白質和硒代蛋白質，通過Ni2+-NTA親和層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化目的蛋白質，再用Hiload Superdex200凝膠層析柱分析其在溶液中的聚集狀態(tài)，用Hampton試劑盒初篩晶體及棋盤法優(yōu)化晶體。運用X-ray衍射儀收集衍射數(shù)據(jù)，解析其三維結構。運用重疊延伸PCR和等位替換原理進行基因敲除和定點突變，在此基礎上通過藥敏試驗了解SdrE與金黃色葡萄球菌耐藥性的關系；Pull-down、SPR、ITC等生化實驗驗證SdrE與蛋白質相互作用位點；粘附和侵襲等細胞實驗分析SdrE與金黃色葡萄球菌感染的關系；小鼠等實驗動物研究進一步分析SdrE與金黃色葡萄球菌毒力的關系。 結果構建了融合質粒pW28-SdrE，并在E.coli B834中可溶性表達。獲得了純度較高(95%)的SdrE母體蛋白質，該蛋白在溶液中以單體形式存在；同時表達純化出純度約為85%的SdrE硒代蛋白質。獲得了SdrE母體蛋白質單晶和硒代蛋白質單晶，并在上海光源實驗室收集到兩套高分辨率的衍射數(shù)據(jù)。SdrE蛋白質晶體屬于P222空間群，晶胞參數(shù)為a=45.19，b=66.35，c=146.22，其中，每一個晶體學不對稱單位包含1個蛋白質分子，相應的結構解析工作正在進行。成功的構建了金黃色葡萄球菌SdrE基因缺失菌株，并通過細胞實驗表明SdrE與金黃色葡萄球菌的侵襲能力密切相關。 結論利用經(jīng)典的蛋白質純化技術和晶體培養(yǎng)技術，獲得衍射能力較強的蛋白質單晶，其三維結構的解析正在進行，通過基因敲除和細胞實驗驗證了SdrE與金黃色葡萄球菌感染相關，為基于結構的新型特異性抗菌藥物的研發(fā)提供了重要的理論基礎。
【關鍵詞】：金黃色葡萄球菌 表面蛋白質SdrE 蛋白質晶體 基因敲除 抗菌藥物
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-15
• 參考文獻13-15
• 第一章 金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的結構研究15-42
• 第一節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的克隆、表達及純化16-35
• 1 材料與方法16-28
• 2 結果28-34
• 3 討論34-35
• 第二節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的三維結構分析35-40
• 1 材料與方法35-37
• 2 結果37-40
• 3 討論40
• 參考文獻40-42
• 第二章 金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的功能研究42-63
• 第一節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的基因敲除43-57
• 1 材料和方法43-51
• 2 結果51-56
• 3 討論56-57
• 第二節(jié) 金黃色葡萄球菌表面蛋白質 SdrE 的毒力分析57-61
• 1 材料和方法57-59
• 2 結果59-60
• 3 討論60-61
• 參考文獻61-63
• 全文總結63-64
• 文獻綜述64-72
• 參考文獻68-72
• 致謝72-73
• 發(fā)表的論文、參加的學術會議及參與的科研項目73-75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林亞靜;劉志杰;龔為民;;蛋白質結構研究[J];生命科學;2007年03期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 牛司強;一種肺炎鏈球菌溶菌酶樣假想蛋白質SP0987的結構和功能研究[D];重慶醫(yī)科大學;2011年

  本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌表面蛋白質SdrE的結構和功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：356030