本文關(guān)鍵詞：HCV中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備及其誘導(dǎo)的中和抗體的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染目前已成為全球性的社會公共衛(wèi)生問題之一。HCV感染后極易慢性化，發(fā)展為終末期肝病，肝硬化甚至肝癌，對HCV感染的治療多使用重組α干擾素（interferon-α, IFN-α），或聯(lián)合廣譜抗病毒藥物利巴韋林（ribavirin），但治療效果不佳，有一定的副作用，且不同型別對IFN反應(yīng)性差別較大。迄今為止，尚未研制出有效的丙肝疫苗，最主要原因是HCV型別多樣，基因高度變異。大多數(shù)的變異與包膜蛋白基因的高變區(qū)有關(guān)，研究較多的是E2基因區(qū)的HVR1。HCV感染后能產(chǎn)生多種抗體，只有針對包膜蛋白的中和抗體才具有保護(hù)作用，因此尋找E1/E2上的中和抗原表位，尤其是能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉中和作用的中和抗原表位是解決其高變性的有效途徑之一。近些年來，HCV假病毒顆粒（HCVpseudo-particle, HCVpp）、HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)（HCVcc）的建立和應(yīng)用于中和抗體測定及其評價方法的建立，使人們對HCV中和抗體在機體適應(yīng)性免疫中的作用，尤其是交叉保護(hù)作用認(rèn)識逐漸深入。誘導(dǎo)廣譜交叉保護(hù)作用中和抗體的HCV疫苗研究將成為新的熱點。 本研究通過構(gòu)建嵌合中和抗原表位的表達(dá)載體，利用乙肝小包膜蛋白（HBsAg-S）能夠自我裝配及攜帶外源性抗原的特點，制備病毒樣顆粒，并對其進(jìn)行鑒定；經(jīng)純化、濃縮后免疫小鼠，觀察小鼠體內(nèi)中和抗體產(chǎn)生情況，為設(shè)計HCV中和抗體疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 1. HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在293T細(xì)胞中的表達(dá) 目的構(gòu)建HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合基因重組表達(dá)載體并證實其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。方法通過查閱文獻(xiàn)，選擇三個HCV E1和E2區(qū)保守的線性中和抗原表位，以及一個針對HVR1的模擬表位，確定其氨基酸序列分別為ITGHRMAWDMMMNWS， QLINTNGSWHIN， GVPTYSWGENET，ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。擴增HBV S抗原基因，在HBV S親水區(qū)127和128位氨基酸序列處引入Age I酶切位點。將表位基因分別插入該位點，構(gòu)建嵌合的重組HBV S基因，再將該基因克隆至真核表達(dá)載體pCI-neo中，構(gòu)建重組的真核表達(dá)載體pCI-HBSEm（pCI-HBSE1-4）。瓊脂糖凝膠電泳對酶切的重組載體進(jìn)行鑒定證實各條帶大小與預(yù)期相符。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行真核表達(dá)。結(jié)果間接免疫熒光分析(indirect immunofluorescence assay, IFA)顯示，四種嵌合質(zhì)粒pCI-HBSEm（pCI-HBSE1-4）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后在胞漿內(nèi)能夠觀察到明顯的綠色熒光，而非重組載體pCI-neo作為陰性對照組轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞包漿內(nèi)則未觀察到明顯綠色熒光；western blot法對嵌合質(zhì)粒pCI-HBSEm轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的裂解液進(jìn)行鑒定，可見相對分子質(zhì)量約27KD處的蛋白條帶，而pCI-neo轉(zhuǎn)染細(xì)胞后未見此條帶。結(jié)論以上陽性結(jié)果表明重組真核表達(dá)載體pCI-HBSEm構(gòu)建成功，并在293T細(xì)胞中能夠進(jìn)行有效表達(dá)。 2. HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒的制備及鑒定目的制備HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒并對其進(jìn)行鑒定。方法293T細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至90%密度時，將構(gòu)建的HCV中和抗原表位與HBVS抗原嵌合重組真核表達(dá)載體pCI-HBSEm用脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，得到自我裝配的嵌合HCV中和表位的HBV病毒樣顆粒（virus-likeparticles, VLPs）。為了純化VLPs，分9層配制梯度為20%-60%的蔗糖溶液進(jìn)行密度梯度離心，通過電化學(xué)發(fā)光法對離心后每層溶液進(jìn)行HBsAg定量測定，檢測到富集的VLPs，該層即為分離的VLPs片段。大量收集該片段進(jìn)行透析后，用離心濃縮管進(jìn)行濃縮，電鏡分析進(jìn)行鑒定。通過HBsAg的測定對純化的VLPs進(jìn)行定量，并與商品化的乙肝疫苗濃度進(jìn)行比較。結(jié)果重組真核表達(dá)載體pCI-HBSEm轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞制備出嵌合HCV中和表位的HBV VLPs，經(jīng)純化濃縮后在電鏡下可見大小約22nm的球形顆粒，與報道中HBsAg-S蛋白形成的亞病毒顆粒吻合。HBsAg定量結(jié)果均值最高達(dá)到5.51×103ng/ml。純化的VLPs作為包被抗原能夠檢測到部分HCV感染患者體內(nèi)存在一定量的中和抗體。結(jié)論我們成功制備出嵌合HCV中和抗原表位的HBVVLPs，且純化、濃縮后的VLPs達(dá)到較高的濃度水平，可與某些HCV患者血清產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)。并能滿足后續(xù)的實驗和動物免疫要求，為進(jìn)一步分析誘導(dǎo)的中和抗體研究奠定基礎(chǔ)。 3. HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠中和抗體的檢測目的HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠并對其抗血清中和抗體的產(chǎn)生情況進(jìn)行檢測分析。方法將42只雄性BLAB/c小鼠隨機分為7組，每組6只。每組注射相應(yīng)抗原/佐劑混合物，按照所注射的抗原分別命名為VLPs-HBSE1、VLPs-HBSE2、VLPs-HBSE3、VLPs-HBSE4、VLPs-pools、VLPs-S、Adjuvant (Adj)。前四組每只小鼠分別注射相應(yīng)的0.3ml500ng VLPs和0.3ml佐劑混合物共0.6ml；VLPs-pools組每只小鼠注射0.3ml四種VLPs等量混合物共500ng和0.3ml佐劑的油包水產(chǎn)物；VLPs-HBs組每只小鼠注射0.3ml500ng VLPs-HBs和0.3ml佐劑混合物共0.6ml；Adj組每只小鼠注射佐劑0.6ml。共免疫三次，每次間隔14天，第一次免疫佐劑用完全弗氏佐劑，，第二、三次用不完全弗氏佐劑。自第一次免疫之日起尾靜脈采血100μl/只，每隔14天采血一次，至第70天共采血6次。采集全血離心后分離血清-20℃保存，用于抗血清中和抗體檢測分析。ELISA法分別以E1-E4四種交聯(lián)抗原肽、交聯(lián)肽的混合溶液、HbsAg陽性患者血清作為包被抗原對免疫小鼠抗血清進(jìn)行檢測，測量OD值隨采血時間推移其中和抗體的產(chǎn)生，變化情況。結(jié)果每種包被抗原與相應(yīng)的免疫小鼠抗血清均產(chǎn)生了較明顯的抗原抗體反應(yīng)，但以混合病毒樣顆粒為免疫原組小鼠血清反應(yīng)性更明顯。結(jié)論HCV嵌合病毒樣顆�？梢栽贐LAB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)一定水平的中和抗體產(chǎn)生，誘導(dǎo)的抗血清其中和抗體水平較單一免疫原誘導(dǎo)的水平略高但對中和抗體的評價還需進(jìn)行深入研究。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒（HCV） 中和表位 病毒樣顆粒 制備 真核表達(dá) 免疫
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-32
• 第一部分 HCV中和抗原表位與HBVS抗原嵌合基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)32-42
• 1 材料32-34
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞32
• 1.2 主要試劑32-33
• 1.3 實驗儀器和設(shè)備33
• 1.4 表位表位及引物序列合成33
• 1.5 配制試劑33-34
• 2 方法34-37
• 2.1 表位選擇和引物設(shè)計34-35
• 2.2 重組質(zhì)粒 pCI-HBS 的構(gòu)建及嵌合基因酶切位點的引入35-36
• 2.3 HCV 中和抗原表位與 HBV S 基因擴增及克隆36
• 2.4 HCV 中和抗原表位與 HBV S 嵌合基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建36
• 2.5 嵌合基因重組載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)36-37
• 3 結(jié)果37-40
• 3.1 HBV S 基因擴增產(chǎn)物及重組質(zhì)粒 pCI-HBS 的鑒定37-38
• 3.2 嵌合基因重組質(zhì)粒 T-HBSE1-4 的鑒定38
• 3.3 嵌合基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒 T-HBSE1-4 的鑒定38-39
• 3.4 嵌合基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒在 293T 細(xì)胞中的表達(dá)39-40
• 4 討論40-42
• 第二部分 HCV 中和抗原表位與 HBV S 抗原嵌合病毒樣顆粒的制備及鑒定42-50
• 1 材料42-43
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞42
• 1.2 主要試劑42
• 1.3 實驗儀器和設(shè)備42-43
• 1.4 配制試劑43
• 2 方法43-45
• 2.1 嵌合 VLPs 的制備、純化及鑒定43-45
• 2.2 嵌合病毒樣顆粒的定量45
• 2.3 ELISA 法檢測嵌合 VLPs 與 HCV 感染患者血清反應(yīng)45
• 3 結(jié)果45-48
• 3.1 嵌合 VLPs 經(jīng)蔗糖密度梯度離心后的純化結(jié)果45-46
• 3.2 嵌合 VLPs 的電鏡分析46-47
• 3.3 嵌合 VLPs 的定量分析47
• 3.4 嵌合 VLPs 作為包被抗原與 HCV 感染患者血清反應(yīng)47-48
• 4 討論48-50
• 第三部分 HCV中和抗原表位與HBVS抗原嵌合病毒樣顆粒免疫小鼠中和抗體的檢測50-57
• 1 材料50-51
• 1.1 實驗動物50
• 1.2 實驗儀器及設(shè)備50
• 1.3 實驗試劑及耗材50-51
• 1.4 配制試劑51
• 2 方法51-54
• 2.1 免疫 BLAB/c 小鼠51-52
• 2.2 ELISA 法測中和抗體52-54
• 3 結(jié)果54-56
• 3.1 免疫小鼠一般情況54
• 3.2 免疫小鼠抗血清檢測54-56
• 4 討論56-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-68
• 個人簡歷和研究成果68-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李學(xué)仁;陳紅;王文;鄧瑤;齊香榮;高瑛瑛;孟昕;譚文杰;阮力;;三個HIV-1廣譜中和表位與HBV S抗原融合表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠特異性抗體應(yīng)答[J];病毒學(xué)報;2008年04期

  本文關(guān)鍵詞：HCV中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒的制備及其誘導(dǎo)的中和抗體的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：354390