發(fā)布時(shí)間：2017-05-10 01:03

  本文關(guān)鍵詞：類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與腸出血性大腸桿菌蛋白EspA的融合表達(dá)及其免疫學(xué)性質(zhì)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：類鼻疽(Melioidosis)疾病是由類鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei）引起的一種熱帶亞熱帶地區(qū)人畜共患傳染病。由于類鼻疽病易感動(dòng)物的廣譜性、疾病的高致死性以及流行范圍不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，該病已經(jīng)成為全球的公共衛(wèi)生問(wèn)題。類鼻疽伯克霍爾德菌是一種革蘭氏陰性桿菌，有極高的感染性和對(duì)環(huán)境的極強(qiáng)的抵抗能力，已被美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心列為B類生物戰(zhàn)劑。此外臨床上類鼻疽桿菌感染的多重耐藥菌性，使得其感染的治療是異常困難。因此發(fā)展新的預(yù)防和治療策略非常重要。 疫苗是預(yù)防和控制感染性疾病有效、經(jīng)濟(jì)的手段。就類鼻疽桿菌疫苗研究而言，已經(jīng)有很多研究就全菌滅活疫苗、成份疫苗、結(jié)合疫苗等方面進(jìn)行了嘗試，但目前還沒(méi)有一種應(yīng)用于臨床。重組亞單位疫苗是通過(guò)重組表達(dá)能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原分子(主要是蛋白抗原)，從而達(dá)到預(yù)防和控制疾病的目的。亞單位疫苗因?yàn)槠涑煞萸宄�、質(zhì)量可控、成本較低，已經(jīng)成為新型疫苗發(fā)展的重要方向。 鞭毛蛋白(flagellin, FliC)作為細(xì)菌表面主要抗原，其氨基酸序列高度保守，是引起免疫反應(yīng)的重要抗原成份之一，已廣泛用于該細(xì)菌感染的診斷，并可作為亞單位疫苗的候選抗原成份。本文分別采用pET22b、pET28a以及pGEX載體進(jìn)行FliC的表達(dá)，結(jié)果均不理想。課題組前期在研究腸出血性大腸桿菌(EHEC) O157:H7的Ⅲ型分泌系統(tǒng)重要元件(Escheriochia coli secret protein A，EspA)的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)外源蛋白表達(dá)的作用，，并構(gòu)建了基于EspA的表達(dá)載體pEspA。本研究擬采用該表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與EHEC O157:H7EspA融合蛋白，并評(píng)價(jià)其免疫學(xué)性質(zhì)，為發(fā)展針對(duì)類鼻疽桿菌和EHEC O157:H7的二聯(lián)疫苗奠定基礎(chǔ)。 方法 1bpsl3319基因的克隆和重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 以類鼻疽桿菌BPC006基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增FliC編碼基因bpsl3319，通過(guò)DNA重組技術(shù)連接到不同表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)、pET28a (+)、pGEX和pEspA，酶切后測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組子，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，獲得重組表達(dá)工程菌。 2重組蛋白EspA-FliC的表達(dá)和純化 重組工程菌pEspA-FliC經(jīng)IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，超聲破菌，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白EspA-FliC表達(dá)形式。EspA-FliC融合蛋白經(jīng)過(guò)包涵體洗滌、使用陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析，純化后產(chǎn)物超濾離心濃縮，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。 3融合蛋白EspA-FliC免疫學(xué)性質(zhì)研究 3.1融合蛋白的反應(yīng)性檢測(cè)Western blot檢測(cè)融合蛋白與類鼻疽桿菌多抗和EspA單克隆抗體、EspA多抗免疫反應(yīng)性。 3.2融合蛋白的免疫原性檢測(cè)純化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA方法檢測(cè)血清特異性抗體的滴度；并通過(guò)Western blot檢測(cè)免疫血清與類鼻疽桿菌全菌、融合蛋白及EspA的反應(yīng)性。 結(jié)果 1成功克隆了類鼻疽桿菌FliC編碼基因bpsl3319，并構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-bpsl3319、pET28a-bpsl3319、pGEX-bpsl3319和pEspA-bpsl3319，F(xiàn)liC在前三種表達(dá)系統(tǒng)中未見(jiàn)明顯表達(dá)，僅在pEspA系統(tǒng)獲得高效表達(dá)。 2重組工程菌pEspA-FliC/BL21經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，融合蛋白EspA-FliC表達(dá)量約占菌體總蛋白的35％，純化后蛋白純度大于85％。 3EspA-FliC能分別與抗類鼻疽桿菌多克隆抗體、抗EspA的單抗或多抗血清發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性。 4EspA-FliC免疫Balb/c小鼠可刺激其產(chǎn)生高效價(jià)特異的IgG，而且此抗體能識(shí)別EspA-FliC、EspA以及天然類鼻疽桿菌的FliC，表現(xiàn)出良好的免疫原性。 結(jié)論 本研究采用DNA重組技術(shù)成功表達(dá)了具有良好免疫原性和免疫反應(yīng)性的類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與腸出血性大腸桿菌EspA的融合蛋白，為研制類鼻疽桿菌和腸出血性大腸桿菌O157：H7的二聯(lián)疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：類鼻疽伯克霍爾德桿菌 鞭毛蛋白FliC 腸出血性大腸桿菌O157 H7 EspA 融合蛋白 疫苗
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R392;R3416
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• Abstract6-9
• 摘要9-11
• 1. 前言11-15
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料15-22
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法22-32
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-45
• 5. 討論45-47
• 全文總結(jié)47-48
• 參考文獻(xiàn)48-57
• 文獻(xiàn)綜述(譯文) 類鼻疽疫苗的研究進(jìn)展57-73
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文73-74
• 致謝74

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 程琰;羅萍;張衛(wèi)軍;顧江;鄒全明;毛旭虎;;EspA-Stx2A1融合蛋白的表達(dá)、純化及其免疫學(xué)活性[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2008年12期

  本文關(guān)鍵詞：類鼻疽桿菌鞭毛蛋白FliC與腸出血性大腸桿菌蛋白EspA的融合表達(dá)及其免疫學(xué)性質(zhì)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：353659