背景：心血管疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康、危及人類生命的疾病。近年來(lái)干細(xì)胞移植療法治療缺血性心肌病成為研究的熱點(diǎn)。許多種干細(xì)胞或干細(xì)胞分化而來(lái)的細(xì)胞都可作為移植的種子細(xì)胞。盡管移植細(xì)胞后心肌功能有所改善,但移植細(xì)胞的存活率極低,及與宿主細(xì)胞間整合不良,可能導(dǎo)致移植后心律失常的發(fā)生,遠(yuǎn)期預(yù)后不佳。這仍是一個(gè)有待解決的重要問(wèn)題。目的：研究小鼠胚胎心室肌細(xì)胞與小鼠胚胎干細(xì)胞之間的相互作用以及共培養(yǎng)對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞分化細(xì)胞間的縫隙連接形成、分布、功能方面的影響。方法：本實(shí)驗(yàn)中,我們采用經(jīng)典的懸滴—懸浮—貼壁法共培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞（mES）與小鼠胚胎心室肌細(xì)胞（mEVs）,在共培養(yǎng)期間顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況、擬胚體（EBs）形態(tài)以及EBs的跳動(dòng)情況；劃痕負(fù)載染料遷移實(shí)驗(yàn)（SLDT）檢測(cè)細(xì)胞間縫隙連接傳導(dǎo)功能；從mRNA及蛋白水平研究心肌及縫隙連接相關(guān)基因的表達(dá)。免疫熒光染色確定連接蛋白的分布情況。從而研究細(xì)胞間相互作用以及mES分化而來(lái)的心肌細(xì)胞的功能。結(jié)果：（1）在mEVs與mES細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中,mES形成的擬胚體自發(fā)搏動(dòng)的比率在分化中期較對(duì)照組明顯增加；（2）共培養(yǎng)組與對(duì)照組間心肌標(biāo)志物... 

【文章來(lái)源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：90 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
目錄
英文縮略詞表
摘要
Abstract
1. 引言
2. 材料和方法
    2.1 技術(shù)路線
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2.2 細(xì)胞株
        2.2.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        2.2.4 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及耗材
        2.2.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.3.2 MEF的原代培養(yǎng)
        2.3.3 MEF細(xì)胞的傳代及絲裂霉素處理
        2.3.4 mES細(xì)胞傳代
        2.3.5 mES細(xì)胞的分化-懸滴法
        2.3.6 mEVs的原代分離培養(yǎng)
        2.3.7 共培養(yǎng)處理
        2.3.8 劃痕負(fù)載染料遷移實(shí)驗(yàn)(SLDT)
        2.3.9 RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄
        2.3.10 多聚酶鏈反應(yīng)
        2.3.11 蛋白的提取
        2.3.12 BCA法測(cè)蛋白濃度
        2.3.13 Western Blot
        2.3.14 免疫熒光染色
        2.3.15 分化細(xì)胞的熒光標(biāo)記
        2.3.16 流式細(xì)胞術(shù)
        2.3.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 MEF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
    3.2 mES的形態(tài)學(xué)觀察
    3.3 分化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
    3.4 EBs跳動(dòng)比率的觀察
    3.5 EBs跳動(dòng)節(jié)律的觀察
    3.6 mES分化細(xì)胞cTNT的表達(dá)
    3.7 細(xì)胞的標(biāo)記示蹤
    3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)
    3.9 縫隙連接功能測(cè)定
    3.10 Cx43的mRNA表達(dá)
    3.11 Cx43的蛋白表達(dá)
    3.12 心肌細(xì)胞間Cx43的分布
4. 討論
    4.1 共培養(yǎng)組與對(duì)照組均能分化出自發(fā)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞
    4.2 共培養(yǎng)組與對(duì)照組分化心肌細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯差異
    4.3 共培養(yǎng)組分化表達(dá)cTNT的細(xì)胞是由胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)
    4.4 共培養(yǎng)組分化的心肌細(xì)胞間縫隙連接傳導(dǎo)功能增強(qiáng)
    4.5 共培養(yǎng)組分化細(xì)胞Cx43的表達(dá)高于對(duì)照組
    4.6 共培養(yǎng)組分化的心肌細(xì)胞Cx43規(guī)則排列,位于細(xì)胞間連接處
5. 結(jié)論
6. 工作展望
7. 參考文獻(xiàn)
8. 綜述
    參考文獻(xiàn)
9. 附錄
10. 致謝
附錄



本文編號(hào)：3479895