發(fā)布時間：2017-05-05 14:18

  本文關(guān)鍵詞：EV71通過2A蛋白酶切割Nup62而抑制核轉(zhuǎn)運，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的：研究EV71病毒及其2A蛋白酶對核孔蛋白P62的影響，從而影響核孔復(fù)合物的核轉(zhuǎn)運的功能。研究方法：構(gòu)建帶有核定位信號（NLS）的綠色熒光蛋白載體（pGFP-NLS），將此表達載體轉(zhuǎn)染RD細胞24h后，用1TCID50、10TCID50和100TCID50的EV71病毒分別感染細胞，8h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的定位情況；將EV71的2A蛋白酶的真核表達載體與pGFP-NLS共轉(zhuǎn)染RD細胞，轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的定位情況；用1TCID50、10TCID50和100TCID50的EV71病毒分別感染RD細胞，8h后收集細胞，裂解細胞后進行Nup62的western blotting檢測，同時提取細胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄，用EV71-2A的引物進行PCR擴增驗證；將2A蛋白酶真核表達載體轉(zhuǎn)染RD細胞，在轉(zhuǎn)染24h、36h和48h后分別收集細胞，裂解細胞后進行Nup62的western blotting檢測，同時提取細胞的RNA，，逆轉(zhuǎn)錄，用EV71-2A的引物進行PCR擴增驗證。結(jié)果：轉(zhuǎn)染pGFP-NLS載體24h后，用病毒感染8h，由于病毒阻止了綠色熒光蛋白GFP-NLS的核轉(zhuǎn)移，顯微鏡下觀察到使綠色熒光蛋白表達出現(xiàn)滯留于細胞漿中的現(xiàn)象，而未感染病毒的細胞中綠色熒光蛋白表達于細胞核中；將2A蛋白酶的真核表達載體與pGFP-NLS共轉(zhuǎn)染48h后，顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白滯留在細胞漿中，而未轉(zhuǎn)染2A蛋白酶的對照孔內(nèi)綠色熒光蛋白表達于細胞核內(nèi)；不同滴度的EV71病毒感染細胞后的western blotting檢測到病毒感染的RD細胞中Nup62蛋白的表達下降，并且下降具有病毒毒力依賴性，即隨著病毒毒力的增強蛋白表達量隨之下降，而且100TCID50的病毒感染導(dǎo)致細胞中的Nup62出現(xiàn)明顯的被切割條帶，2A的RT-PCR結(jié)果也顯示出病毒能夠在細胞中復(fù)制；轉(zhuǎn)染2A蛋白酶分不同時間收集細胞后的western blotting檢測到細胞中的Nup62表達下降，其中在48h時最為明顯，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)2A的表達具有時間依賴性，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，mRNA的表達增加，反映2A蛋白酶的表達也增加。結(jié)論：本研究證明EV71病毒可通過2A蛋白酶切割核孔蛋白p62，使核孔復(fù)合物的結(jié)構(gòu)受到破壞，從而影響其核轉(zhuǎn)運的功能。
【關(guān)鍵詞】：腸道病毒71型 Nup62 核轉(zhuǎn)運 2A
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373.2
【目錄】：

• 中文摘要5-6
• 英文摘要6-7
• 前言7-9
• 1. 材料與方法9-24
• 2. 結(jié)果24-33
• 3. 討論33-35
• 4. 結(jié)論35-36
• 參考文獻36-40
• 文獻綜述40-51
• 參考文獻46-51
• 注釋和說明清單51-52
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況52-53
• 致謝53-54
• 作者簡介54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：346513