發(fā)布時間：2017-05-03 08:06

  本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒血清學(xué)分型方法的建立及初步臨床評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球約有1.8億人（占全球人口的3%）感染HCV，其中1.3億人為慢性HCV攜帶者。根據(jù)1992～1995年第二次病毒性肝炎血清學(xué)流行病調(diào)查結(jié)果顯示，我國人群抗-HCV的陽性率平均為3.2%，屬于中度流行。丙型肝炎易發(fā)展成慢性，約75%～85%急性肝炎可發(fā)展成慢性肝炎甚至肝硬化和肝癌。感染丙型肝炎病毒的病人在20～30年內(nèi)肝硬化發(fā)生率為10～25%，HCV引發(fā)的肝硬化病人10年后肝功能失代償發(fā)生率為30%，肝癌年發(fā)生率為1%～3%，給我國的公共衛(wèi)生事業(yè)帶來極大的危害。 HCV為單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科，于1989年首次克隆成功，基因組全長約9.5kb，含有一個約9033個核苷酸構(gòu)成的開放讀碼框，編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白(C)，包膜蛋白gp33(E1)、gp70(E2)，非結(jié)構(gòu)蛋白有p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等。由于RNA酶缺少校對功能，整個基因組呈現(xiàn)高度的變異性，目前HCV至少分為6個基因型和80多種以上的亞型。在我國，主要的基因型為1b，其次為2a，還有其它少見型別。 根據(jù)我國《丙型肝炎防治指南》，慢性丙型肝炎標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以聚乙二醇化干擾素α和利巴韋林為主的聯(lián)合治療。其中，基因型是聯(lián)合治療方案的一個重要基線預(yù)測指標(biāo)，對臨床用藥的劑量和時間具有重要指導(dǎo)意義。目前常用的基因分型主要方法包括特異性引物擴(kuò)增后直接測序分析、限制性片段長度酶切多肽性（RFLP）分析、特異性探針PCR法及基因芯片法等，盡管方法的特異性和靈敏度很高，但由于基因分型方法需要HCV RNA提取等過程，操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，一般實(shí)驗(yàn)室難以開展，而且當(dāng)HCV-RNA陰性或由于保存不當(dāng)及處理過程中HCV-RNA遭到破壞時，則不能進(jìn)行基因分型。為此，學(xué)者提出了HCV血清學(xué)分型，即在HCV基因型特異性抗原表位篩選的基礎(chǔ)上，采用血清學(xué)技術(shù)，根據(jù)患者體內(nèi)型特異性抗體的存在情況，進(jìn)行血清學(xué)分型。 目前國際上商品化的HCV血清分型試劑主要有3種，分別是Murex HCV1-6型、Chiron RIBA1-3型和日本HCV1、2血清分型試劑盒。其中美國Abbott公司的Murex HCV1-6型血清分型試劑是根據(jù)HCV-NS4區(qū)基因片段合成1-6型的型特異性多肽，采用抗原競爭免疫酶聯(lián)法，鑒定與基因型相對應(yīng)的不同血清型。由于受到不同國家地區(qū)及標(biāo)本選擇的影響，該試劑臨床評價結(jié)果不盡相同，分型率大致為60%～80%，與基因分型的符合率為90%～97%；Chiron公司研制生產(chǎn)的RIBAHCV血清分型試紙條采用免疫膠體金技術(shù)，根據(jù)NS4區(qū)型特異性表位多肽為主，Core區(qū)型特異性表位多肽為輔進(jìn)行血清學(xué)分型，其分型率能達(dá)到80%以上，特異性在90%～96%；另外日本國際試藥株式會社的HCV Gr分型試劑盒是根據(jù)NS4區(qū)型特異性的抗原肽建立的血清分型試劑，僅能鑒定1、2型，分型率為89.6%，特異性為96.0%。但這些商品化的血清分型試劑在我國尚未注冊，且價格昂貴，難于獲得，因此，，本課題旨在研究建立針對我國主要流行基因型對應(yīng)血清型的分型方法，填補(bǔ)國內(nèi)空白。 本課題根據(jù)文獻(xiàn)報道，從HCV databases數(shù)據(jù)庫（http://hcv.lanl.gov/content/index）下載丙型肝炎病毒NS4區(qū)的氨基酸序列，通過Biosun生物信息學(xué)軟件對HCV-NS4區(qū)序列的抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析，確定HCV-NS4區(qū)抗原表位主要位于1693～1708aa，C區(qū)型別特異性抗原表位位于67～81aa，并通過HCVdatabases數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行同源性比對分析，最后確定NS4區(qū)Ⅰ型氨基酸序列為AⅡPDREVLYQEFDEM，Ⅱ型氨基酸序列為VVAPDKEVLYEAFDEM，C區(qū)I型氨基酸序列為KARRPEGRTWAQPGY， Ⅱ型氨基酸序列為KDRRTTGKSWGRPGY。根據(jù)確定的型別特異性氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢密碼子推斷出其對應(yīng)的核苷酸序列，通過重疊延伸PCR技術(shù)合成C-Ⅰ、C-Ⅱ、NS4-Ⅰ、NS4-Ⅱ、C+NS4-Ⅰ型嵌合及C+NS4-Ⅱ型嵌合基因，酶切后插入PGEX-4T-2載體中，構(gòu)建出6株高效表達(dá)質(zhì)粒，并采用GST瓊脂糖凝膠FF柱進(jìn)行純化，獲得了6個純度均為95%以上的抗原。 通過間接ELISA方法，采用50例抗-HCV抗體陽性的基因分型血清對6個抗原的抗原活性進(jìn)行初步檢測，結(jié)果顯示：獲得的3個Ⅰ型抗原C-Ⅰ、NS4-Ⅰ及C+NS4-Ⅰ嵌合與HCV-1b型血清的反應(yīng)性分別為25.71%、74.28%、88.57%，與HCV-2a型血清之間的交叉反應(yīng)性分別為20.00%、40.00%、66.67%，Ⅰ型抗原與1b血清之間的反應(yīng)性均高于與2a血清的反應(yīng)性，表現(xiàn)出Ⅰ型抗原特有的型別特異性；獲得的3個Ⅱ型抗原C-Ⅱ、NS4-Ⅱ、及C+NS4-Ⅱ嵌合與2a型血清的反應(yīng)性分別為33.33%、66.67%、73.33%，與1b型血清的交叉反應(yīng)性分別為11.42%、48.57%、28.57%，獲得的Ⅱ型抗原與2a型血清的反應(yīng)性顯著高于1b型，表現(xiàn)出Ⅱ型抗原特有的型別特異性。 為了消除型別特異性抗原與I、Ⅱ型血清之間交叉反應(yīng)性，本研究采用競爭免疫酶聯(lián)法，并通過20組不同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HCV血清分型檢測方法的系統(tǒng)優(yōu)化，最終確定HCV血清分型檢測方法的工藝條件為：PH9.6碳酸鹽緩沖液作為包被液；20%山羊血清-0.01M PBS PH7.4為封閉液；LD5-HRP作為酶結(jié)合物（LD5是一種新的、具有更廣泛IgG結(jié)合特性的分子）；確定競爭抗原的濃度為1.5μg/μl；競爭抗原稀釋液為山羊血清(5%)、酪蛋白(0.5%)-0.01M PBS PH7.4；4個NS4-I、C-Ⅰ、NS4-Ⅱ及C-Ⅱ型分片段抗原作為包被抗原，2個I、Ⅱ型嵌合抗原作為競爭抗原，設(shè)計(jì)了HCV血清分型的4孔檢測模式，并確定了結(jié)果判讀的計(jì)算方法。 采用128例HCV-1b血清和72例HCV-2a型血清對該技術(shù)進(jìn)行初步的臨床評價，檢出Ⅰ型102例，Ⅱ型58例，I、Ⅱ混合型2例，整體分型率為81.00%，與基因分型方法之間具有很好的一致性，其符合率分別為97.05%（kappa=0.959，p=0.024），接近國際報道。進(jìn)一步研究顯示：本血清分型方法與117例非HCV感染的肝炎及其他肝病患者血清之間沒有明顯的交叉性，且分型效率與患者的年齡、抗體S/Co、HCV RNA滴度無關(guān)。 本研究的創(chuàng)新之處在于采用包含C區(qū)、NS4區(qū)兩個區(qū)段的型別特異性抗原進(jìn)行HCV血清分型，克服了抗體譜單一的問題，提高了樣本分型率；除此以外，本研究引入競爭免疫酶聯(lián)技術(shù)進(jìn)行HCV血清分型及工藝優(yōu)化的研究，相比間接酶聯(lián)免疫技術(shù)，極大的提高了HCV血清分型的準(zhǔn)確率。 本研究建立的以競爭免疫酶聯(lián)技術(shù)為基礎(chǔ)的HCV血清型分型方法，與基因分型技術(shù)間具有很好的一致性，且操作簡單、快速、不易污染，也不需要特殊儀器設(shè)備和專業(yè)人員，特別適合我國基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣使用，有很好的臨床應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：丙型肝炎病毒 競爭抑制酶聯(lián)免疫技術(shù) 基因分型 血清分型
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373.21
【目錄】：

• 目錄3-6
• 縮略詞表6-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一章 丙型肝炎病毒型別特異性抗原的克隆表達(dá)及純化16-39
• 1 材料和方法16-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 1.1.1 菌株及質(zhì)粒16
• 1.1.2 工具酶與試劑盒16
• 1.1.3 試劑16
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備16-17
• 1.1.5 主要配制試劑17-19
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-24
• 1.2.1 抗原表位分析19
• 1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建19-22
• 1.2.2.1 退火延伸PCR法合成HCV血清I、Ⅱ型抗原基因19-20
• 1.2.2.2 PCR產(chǎn)物的回收20
• 1.2.2.3 PGEX-4T-2 質(zhì)粒抽取20-21
• 1.2.2.4 酶切21
• 1.2.2.5 連接21
• 1.2.2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定21-22
• 1.2.2.7 產(chǎn)物序列測定22
• 1.2.3 工程菌的誘導(dǎo)22-23
• 1.2.4 蛋白的純化23
• 1.2.5 抗原純度測定23
• 1.2.6 抗原活性鑒定23-24
• 1.2.7 抗原交叉反應(yīng)性鑒定24
• 1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析24
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-36
• 2.1 HCV 型別特異性抗原表位的確定24-27
• 2.2 HCV血清I、Ⅱ型基因片段的獲得27-28
• 2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定28-30
• 2.4 目的蛋白的純化及純度分子量鑒定30-32
• 2.5 抗原活性鑒定32-34
• 2.7 抗原交叉反應(yīng)性鑒定34-36
• 3 討論36-39
• 第二章 丙型肝炎病毒血清學(xué)分型方法的建立及優(yōu)化39-55
• 1 材料與方法39-44
• 1.1 材料39-40
• 1.1.1 儀器設(shè)備39
• 1.1.2 試劑配制39-40
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法40-44
• 1.2.1 封閉液的確定40-41
• 1.2.2 酶結(jié)合物的確定41
• 1.2.3 競爭抗原濃度的確定41
• 1.2.4 競爭抗原稀釋液的確定41-42
• 1.2.5 不中和孔cut-off值的確定42
• 1.2.6 抗原的組合配對42-44
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-52
• 2.1 封閉液的確定44
• 2.2 酶結(jié)合物的確定44-45
• 2.3 競爭抗原濃度的確定45-46
• 2.4 競爭抗原稀釋液的確定46
• 2.5 不中和孔cut-off值的確定46-47
• 2.6 抗原的組合配對47-52
• 3 討論52-55
• 第三章 丙型肝炎病毒血清學(xué)分型方法的初步臨床評價55-66
• 1 材料與方法55-58
• 1.1 材料55-56
• 1.1.1 標(biāo)本來源55
• 1.1.2 儀器設(shè)備55
• 1.1.3 試劑配制55-56
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法56-58
• 1.2.1 血清處理56
• 1.2.2 HCV RNA 檢測56
• 1.2.3 HCV基因分型56
• 1.2.4 抗HCV 檢測56-57
• 1.2.5 HCV 血清分型檢測57-58
• 1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析58
• 1.2.7 與其他肝病患者血清的交叉反應(yīng)58
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-64
• 2.1 抗HCV抗體及HCV RNA 檢測58
• 2.2 HCV 基因分型58
• 2.3 HCV 血清分型58-63
• 2.4 HCV血清型與基因型的符合率63
• 2.5 年齡、抗體S/Co 、HCV RNA與分型間的關(guān)系63-64
• 2.6 與其他肝病患者血清的交叉反應(yīng)64
• 3 討論64-66
• 結(jié)論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 致謝71-72
• 個人簡歷72-74
• 文獻(xiàn)綜述74-83
• 參考文獻(xiàn)78-83
• 附 發(fā)表論文83-93

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒血清學(xué)分型方法的建立及初步臨床評價，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：342635