本文關(guān)鍵詞：黃連素體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：對(duì)分離培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells, hUMSCs）生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，探討黃連素在體外定向誘導(dǎo)hUMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用和條件，為定向誘導(dǎo)hUMSCs向神經(jīng)分化以及在臨床上的應(yīng)用提供理論支持和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：取足月剖宮產(chǎn)健康新生兒臍帶，用D-Hank’s充分沖洗，剔除臍動(dòng)脈、臍靜脈，將所剩的臍帶間質(zhì)組織用組織剪切成1mm3大小的組織塊，0.2%膠原酶Ⅱ消化，在含20%胎牛血清（FBS）、2ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、25mM左旋谷氨酰胺（L-Glu）、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12中培養(yǎng)。觀察提取的原代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞融合至80％～90％密度時(shí)，加入0.25%胰酶-1mM EDTA進(jìn)行消化，并傳代。 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)首次消化后收集的細(xì)胞表型進(jìn)行檢測(cè)，，包括CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和組織相容性抗原HLA-DR (MHC-II)，以抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對(duì)照。 原代hUMSCs按比例1:1傳代后記作P1代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)速度，細(xì)胞融合達(dá)到90%以上時(shí)按1:2或1:3比例傳代，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好P4代的hUMSCs，分為五組：200μg/ml組、100μg/ml組、50μg/ml組、25μg/ml組和對(duì)照組。以3×104/孔的密度接種于5個(gè)多聚賴氨酸包被的六孔板中（每個(gè)六孔板為一組），待細(xì)胞融合達(dá)到70-80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的四個(gè)六孔板分別換為含有200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml黃連素的無血清低糖DMEM/F12培養(yǎng)基的誘導(dǎo)液；對(duì)照組六孔板除不加黃連素外，其余均同實(shí)驗(yàn)組。倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，每12小時(shí)一次，連續(xù)觀察7天，每24h對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，檢測(cè)其神經(jīng)元標(biāo)志（NSE）、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志（GFAP）和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志（Nestin）的表達(dá)情況。各組隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，拍照記錄計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，用以計(jì)算分化率，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。分析不同濃度黃連素誘導(dǎo)hUMSCs的分化率。 結(jié)果：原代細(xì)胞消化、傳代12h后，大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈三角形、菱形、橢圓形、圓點(diǎn)等形態(tài)；隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變成均一的長(zhǎng)梭形，數(shù)量增多。培養(yǎng)7-8d時(shí)細(xì)胞融合可達(dá)80%-90%，低倍鏡下看到hUMSCs呈放射狀、漩渦狀排列。按照1:2的比例再傳代，連續(xù)傳至P15代，hUMSCs仍保持旺盛的增殖能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3、P5和P10代細(xì)胞表面分子標(biāo)記，結(jié)果顯示各代均表達(dá)CD73、CD90和CD105，而不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR。 加入黃連素誘導(dǎo)液后24h，200μg/ml組和100μg/ml組有個(gè)別細(xì)胞開始發(fā)生形態(tài)改變，光學(xué)顯微鏡下可見：胞體收縮變圓，折光度增強(qiáng)，伸出指狀突起；50μg/ml組、25μg/ml組細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞胞體進(jìn)一步收縮，突起增長(zhǎng)。36h后部分細(xì)胞出現(xiàn)雙極突起，以200μg/ml組變化最為明顯。48h后200μg/ml、100μg/ml組細(xì)胞突起較前更加細(xì)長(zhǎng)，并可多達(dá)2至5條，有的細(xì)胞突起逐漸發(fā)展成多級(jí)，并彼此接觸交叉，呈神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)；此時(shí)，50μg/ml組亦可見到少量細(xì)胞胞體收縮、指狀突起形成；25μg/ml組則未見明顯變化。60h后200μg/ml、100μg/ml組內(nèi)相臨細(xì)胞連接形成樹突樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加典型，但200μg/ml組內(nèi)出現(xiàn)少量細(xì)胞脫落、漂浮；50μg/ml組中有突起細(xì)胞數(shù)較前亦稍有增多；而25μg/ml組仍未見明顯變化。72h后各組中有形態(tài)變化細(xì)胞的數(shù)量未見到明顯增多。隨誘導(dǎo)液的持續(xù)作用，分化傾向的細(xì)胞表現(xiàn)為越來越典型的神經(jīng)樣形態(tài)，同時(shí)漂浮、死亡的細(xì)胞也在逐漸增多，以200μg/ml組死亡細(xì)胞數(shù)最多，僅剩少量細(xì)胞存活且細(xì)胞透亮度降低；100μg/ml、50μg/ml組存活的細(xì)胞表現(xiàn)為更為典型的神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)：細(xì)胞胞質(zhì)向胞核收縮，胞體折光增強(qiáng)，形成雙極、多極突起，突起伸長(zhǎng)較前更加明顯，可見2、3級(jí)突起，有的呈放射狀伸展，且直到誘導(dǎo)5天后這些典型神經(jīng)樣細(xì)胞開始出現(xiàn)明顯脫落、漂浮。免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見大量NSE、GFAP和Nestin陽性表達(dá)的神經(jīng)樣細(xì)胞，各標(biāo)志物陽性表達(dá)率在不同藥物濃度作用下隨時(shí)間的變化依次為：200μg/ml組NSE（15.0±3.9、81.4±5.8、57.7±7.7、39.1±4.3、25.4±6.8、8.3±4.0、0.0±0.0），GFAP（15.0±4.0、81.3±8.1、56.3±5.6、39.3±5.4、27.1±6.9、8.6±3.2、0.0±0.0），Nestin（14.8±4.0、80.3±7.3、55.9±5.6、38.6±4.9、25.4±6.8、7.9±3.5、0.0±0.0）；100μg/ml組NSE（6.4±3.2、50.4±4.7、87.7±4.6、86.6±5.7、85.2±5.0、64.5±6.6、37.2±5.4），GFAP（6.9±3.7、50.8±5.7、87.5±4.0、87.0±5.9、85.3±4.7、66.1±5.0、38.3±4.9），Nestin（6.3±3.2、50.1±5.0、87.2±4.1、86.6±5.6、84.8±5.3、64.4±6.5、37.3±5.3）；50μg/ml組NSE（0.0±0.0、3.6±2.3、14.3±5.3、13.8±4.4、15.6±6.3、15.8±6.5、15.6±5.7），GFAP（0.0±0.0、3.5±3.0、12.4±6.3、13.8±4.7、15.0±4.2、15.2±5.3、15.1±4.1），Nestin（0.0±0.0、2.8±3.3、12.9±6.5、14.5±5.9、14.9±4.8、15.4±5.6、15.2±5.1）。免疫熒光染色同樣呈現(xiàn)GFAP、NSE、Nestin陽性表達(dá)；對(duì)照組免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光染色均呈陰性。 結(jié)論:人臍帶經(jīng)分離純化可得到表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD73、CD90和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b、CD19、CD34、CD45和組織相容性抗原HLA-DR （MHC-Ⅱ），具有較高增殖能力，可在體外穩(wěn)定傳代的hUMSCs；黃連素在體外可誘導(dǎo)hUMSCs分化成神經(jīng)樣細(xì)胞，并表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志（NSE）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志（GFAP）、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志（Nestin），以黃連素濃度為100μg/ml組最為明顯，且存活時(shí)間最長(zhǎng)。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 黃連素 分化 神經(jīng)樣細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-18
• 結(jié)果18-21
• 附圖21-34
• 附表34-37
• 討論37-40
• 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-46
• 綜述 中藥誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究46-57
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57-58
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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2 劉金保,董曉先,董燕湘,何慧華,董偉華,梁仲培,肖慶忠;當(dāng)歸誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞[J];廣東醫(yī)學(xué);2003年05期

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本文編號(hào)：342426