本文關(guān)鍵詞：西藏小型豬糖尿病模型的建立及胰島細(xì)胞分離純化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[研究背景] 糖尿病是一組以慢性血葡萄糖(簡(jiǎn)稱血糖)水平增高為特征的代謝疾病群。高血糖是由于胰島素分泌缺陷和(或)胰島素作用缺陷引起的。除碳水化合物外,尚有蛋白質(zhì)、脂肪代謝異常。久病可引起多系統(tǒng)損害,病情嚴(yán)重或應(yīng)激時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂。本病使患者生活質(zhì)量降低,壽命縮短,病死率增高。國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(IDF)的最新數(shù)據(jù)顯示,全球糖尿病患者目前已增至3.66億人,預(yù)計(jì)在20年內(nèi)將達(dá)到近6億人。目前,糖尿病的治療,主要有藥物治療和胰島素注射治療,但是無(wú)論是藥物還是注射胰島素,都無(wú)法徹底根治糖尿病,病人需要終生用藥。由于多數(shù)病人存在依從性不好的問(wèn)題,多數(shù)糖尿病患者得不到很好的治療,導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥的出現(xiàn)。長(zhǎng)期服藥或者注射胰島素,不但病人備受疾病的煎熬,而且給病人家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此,人類社會(huì)正積極尋求能夠根治糖尿病的方法。胰島移植被認(rèn)為是目前治療糖尿病的有效方法之一。但胰島來(lái)源緊缺,胰島細(xì)胞供體數(shù)量不足、免疫排斥反應(yīng)等,使得治療效果受到影響。 我國(guó)糖尿病病人總數(shù)世界第一,異種胰島移植治療糖尿病的研究在我國(guó)顯得更為迫切,但是和國(guó)外進(jìn)行的異種胰島移植研究相比,我國(guó)的異種胰島移植研究相對(duì)落后,至今只有少數(shù)幾家單位進(jìn)行過(guò)初步的臨床實(shí)驗(yàn)。國(guó)內(nèi)利用小型豬胰島細(xì)胞異種移植治療糖尿病的臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)效果觀察和安全性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)資料異常缺乏,嚴(yán)重阻礙了臨床應(yīng)用小型豬胰島細(xì)胞異種移植治療糖尿病的開(kāi)展。通過(guò)本項(xiàng)目的實(shí)施可掌握更多異種移植臨床前療效、毒性及安全性評(píng)價(jià)的資料,為臨床異種胰島移植研究提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。小型豬作為大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一,在糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和利用方面類似于人類,豬的胰島素與人類的胰島素只差一個(gè)氨基酸,是治療糖尿病用胰島素的主要來(lái)源,豬胰島的異種移植也成為人類治療糖尿病的新方法。并且其常用血液學(xué)和血液生化指標(biāo)的測(cè)定值與人類近似,隨著年齡的增長(zhǎng),豬可自發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化,便于人們研究糖尿病及其并發(fā)心血管疾病,為糖尿病及其并發(fā)癥的研究提供理想的動(dòng)物模型。 [目的] 本研究通過(guò)藥物誘導(dǎo)的方法建立西藏小型豬糖尿病模型,為了糖尿病研究提供基礎(chǔ)資料；通過(guò)對(duì)胰島細(xì)胞分離純化,以期獲得高質(zhì)量的胰島細(xì)胞,為小型豬胰島細(xì)胞臨床應(yīng)用提供相關(guān)資料和經(jīng)驗(yàn)。 [方法] 選取健康西藏小型豬10頭,單欄飼養(yǎng),每天按動(dòng)物體重的3%喂食飼料,自由飲水。小型豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組各5頭。每日觀察動(dòng)物飲食、飲水、行為、精神等狀況,每周稱量體重一次。小型豬用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉后,實(shí)驗(yàn)組從耳緣靜脈推注鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)和四氧嘧啶(Alloxan,ALX)配置的聯(lián)合藥物,連續(xù)注射3天,對(duì)照組注入等量生理鹽水。注射前,兩組小型豬禁食12小時(shí)(由晚上22點(diǎn)到第二天10點(diǎn))；注射后,將小型豬飼養(yǎng)在較溫暖的環(huán)境,維持體溫。實(shí)驗(yàn)期間每天早晨10點(diǎn)用血糖儀監(jiān)測(cè)小型豬空腹血糖,連續(xù)監(jiān)測(cè)7天。造模成功后每周第一天測(cè)一次空腹血糖,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束監(jiān)測(cè)小型豬血糖變化。每周檢測(cè)糖耐量一次。每次檢測(cè)前一天晚上22點(diǎn)到當(dāng)天10點(diǎn)禁食禁水。檢測(cè)開(kāi)始后,首先將75克葡萄糖粉溶于350毫升飲用水中喂給小型豬,并于飲完后30分鐘、60分鐘、120分鐘和180分鐘分別監(jiān)測(cè)血糖含量。分別在注射前一天和注射結(jié)束后第七天采集一次空腹前腔靜脈血,分離血清,采用酶法進(jìn)行甘油三酯、總膽固醇測(cè)定,采用試劑盒法進(jìn)行糖化血紅蛋白的測(cè)定。 選取健康的7月齡西藏小型豬,安樂(lè)死后,無(wú)菌條件下摘取西藏小型豬整個(gè)胰腺,用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)浸潤(rùn),選取胰頭部位切割組織塊,將表面的被膜、結(jié)締組織和脂肪剔除,PBS沖洗,組織塊剪碎后取均分為4組,對(duì)比不同質(zhì)量濃度的膠原酶(1mg/ml,2mg/ml,3mg/ml,4mg/ml)和同一質(zhì)量濃度不同時(shí)間點(diǎn)(0min,15min,30min,45min,60min,75min,90min)分離獲得胰島細(xì)胞的數(shù)量和效果；使用Ficoll400密度梯度離心、淋巴分離液分離、離心、靜置4種方法純化胰島細(xì)胞懸液,比較最終收集到的胰島細(xì)胞數(shù)量和效果；用雙硫腙(Dithizone,DTZ)染色計(jì)算胰島細(xì)胞的純度；用吖啶橙/碘化丙啶(Acridine orange/Propidium Iodide, AO/PI)染色計(jì)算胰島細(xì)胞存活率。 [結(jié)果] 小型豬糖尿病模型制作實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組藥物注射后,第2天即出現(xiàn)高血糖,并連續(xù)7天穩(wěn)定維持在11mmol/L以上,對(duì)照組血糖未見(jiàn)明顯升高,兩組比較差異有顯著性意義(P0.05)。實(shí)驗(yàn)組糖耐量和糖化血紅蛋白檢測(cè)都有所降低,對(duì)照組無(wú)明顯變化,在糖耐量測(cè)試結(jié)果中,有兩次超過(guò)7.0mmol/L即可判定小型豬已患糖尿病,實(shí)驗(yàn)組小型豬飲用含糖飲用水后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖水平及空腹血糖均明顯高于7.0mmol/L,證明西藏小型豬糖尿病模型成功建立。兩組血液總膽固醇和甘油三酯水平均無(wú)明顯變化,說(shuō)明STZ聯(lián)合ALX注射不能引起小型豬血脂變化,故不能用單純應(yīng)用STZ聯(lián)合ALX藥物注射的方法制作高血脂動(dòng)物模型。 胰島細(xì)胞分離純化確定了不同質(zhì)量濃度的膠原酶獲取胰島細(xì)胞的最佳時(shí)間,膠原酶1mg/ml和2mg/ml組為45min,3mg/ml和4mg/ml組為30min,各組在最佳時(shí)間點(diǎn)獲得胰島細(xì)胞的數(shù)量最多的為1mg/ml組,胰島細(xì)胞形態(tài)完整,具有活性；4種純化方法中,收集的胰島細(xì)胞數(shù)量由多到少依次為靜置組Ficoll400密度梯度離心組離心組淋巴分離液離心組,4種方法獲得的胰島細(xì)胞均具有活性。經(jīng)AO/PI染色后檢測(cè)胰島細(xì)胞的活度為95%以上。 [結(jié)論] 本研究成功對(duì)西藏小型豬胰島細(xì)胞進(jìn)行了分離和純化的最佳條件進(jìn)行了摸索和檢驗(yàn),用STZ聯(lián)合ALX的方法進(jìn)行西藏小型豬糖尿病模型的建立。上述研究為糖尿病防治提供了新的動(dòng)物模型和相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：西藏小型豬 胰島細(xì)胞 糖尿病 鏈脲佐菌素
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R587.1;R-332
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-14
• 前言14-29
• 1 糖尿病研究現(xiàn)狀14-18
• 2 豬胰島細(xì)胞異種移植治療糖尿病的研究進(jìn)展18-20
• 3 小型豬糖尿病模型研究現(xiàn)狀20-24
• 4 胰島細(xì)胞移植方法研究24-28
• 5 展望28-29
• 第一章 西藏小型豬糖尿病模型的建立29-49
• 1 材料與方法29-33
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-45
• 3 討論45-49
• 第二章 西藏小型豬胰島細(xì)胞體外分離和純化方法49-55
• 1 材料與方法49-50
• 2 結(jié)果50-53
• 3 討論53-55
• 全文總結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 附錄61-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要成果63-64
• 致謝64-65

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本文編號(hào)：342126