本文關(guān)鍵詞：濾泡輔助性T細胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：濾泡輔助性T細胞(Follicular T Helper cells，Tfh細胞)是一類全新的T細胞亞群，Tfh細胞在B細胞的發(fā)育、生發(fā)中心的形成、抗體類別轉(zhuǎn)換，建立長期體液免疫應(yīng)答等過程中扮演主要角色。本研究利用表達口蹄疫病毒VP1基因的重組腺病毒疫苗(rAd5VP1)免疫小鼠，通過觀察小鼠脾臟中濾泡輔助性T細胞(T follicular helper cells，Tfh)的分化、生發(fā)中心（GC）的形成、Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表示水平及Tfh細胞主要細胞因子白細胞介素-21(interleukin-21，IL-21)的分泌水平，探討Tfh細胞在口蹄疫重組腺病毒疫苗免疫應(yīng)答中所發(fā)揮的作用。 方法：6周齡BALB/c小鼠，隨機分為兩組，每組10只。實驗組免疫rAd5VP1，對照組注射PBS。 1.免疫后7d，取小鼠脾臟，分離單個核細胞，通過流式細胞術(shù)(FCM)檢測Tfh細胞（CD4~+CXCR5~+PD-1~+）的分化、生發(fā)中心B細胞（B220+GL-7+）的分化；分析CXCR5~+T細胞/CD4~+T細胞的比例、CXCR5~+PD-1~+T細胞/CD4~+T細胞的比例、GL-7+B細胞/B220+B細胞的比例。 2.免疫后7d，取小鼠脾臟，分離單個核細胞，通過real-time RT-PCR技術(shù)檢測Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表達水平。 3.免疫后7d，取小鼠脾臟，常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)FITC-花生凝集素（PeanutAgglutinin, PNA）染色，免疫熒光顯微鏡觀察生發(fā)中心的形成。 4.免疫后7d，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒檢測小鼠血清中Tfh細胞分泌細胞因子IL-21的表達水平。 結(jié)果： 1.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，重組腺病毒疫苗rAd5VP1能誘導(dǎo)小鼠Tfh細胞的分化，而且，單個核細胞中CXCR5~+T細胞/CD4~+T細胞的比例(4.05±0.10)明顯高于PBS對照組（2.14±0.29），P=0.007.**P 0.01；單個核細胞中CXCR5~+PD-1~+T細胞/CD4~+T細胞的比例(1.17±0.17)明顯高于PBS對照組(0.69±0.17)，P=0.03.*P 0.05； 2.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，單個核細胞中GL-7+B細胞/B220+B細胞的比例(3.66±0.53)明顯高于PBS對照組(1.74±0.05)，P=0.02.*P 0.05; 3.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，real-time RT-PCR檢測BCL-6mRNA的相對表達水平得到CT值，進行相對定量處理得到2 ΔΔCT值，再行統(tǒng)計分析得到疫苗rAd5VP1免疫組中BCL-6mRNA表達量是對照組表達量的2.39倍。P=0.001.**P 0.01。 4.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，分離血清，ELISA試劑盒檢測血清中IL-21分泌水平，結(jié)果顯示，rAd5VP1實驗組中IL-21表達量（63.68±13.15，pg/ml）明顯高于PBS對照組表達量(4.65±2.36，pg/ml)，P=0.02.*P 0.05。 5.重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，常規(guī)方法制作石蠟切片，經(jīng)FITC-PNA染色，免疫熒光顯微鏡觀察生發(fā)中心的形成。結(jié)果顯示，重組腺病毒疫苗rAd5VP1能誘導(dǎo)生發(fā)中心的形成，經(jīng)Image J軟件分析平均熒光密度數(shù)值，統(tǒng)計得出，rAd5VP1組表達量（12.54±1.77）明顯高于PBS對照組表達量PBS （6.71±0.55），P=0.00001.**P0.01。 結(jié)論：利用口蹄疫重組腺病毒疫苗rAd5VP1免疫小鼠，7d后，重組腺病毒疫苗能誘導(dǎo)Tfh細胞的分化、促進GC的形成及促進GC B細胞的分化、提高Tfh細胞轉(zhuǎn)錄因子BCL-6mRNA的表示水平，及增強Tfh細胞主要細胞因子IL-21的分泌水平。結(jié)果顯示，在口蹄疫重組腺病毒疫苗誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答中，Tfh細胞及其效應(yīng)分子都起到了非常重要的作用，為進一步優(yōu)化疫苗設(shè)計策略及維持長期體液免疫應(yīng)答的研究提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Tfh細胞 重組腺病毒疫苗 BCL-6 白細胞介素-21 生發(fā)中心
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略語/符號說明9-13
• 前言13-19
• 研究背景17-18
• 研究目的18-19
• 材料與方法19-43
• 1.研究對象19-31
• 1.1 實驗動物19
• 1.2 主要儀器和試劑19-21
• 1.2.1 主要儀器19-20
• 1.2.2 主要試劑20-21
• 1.3 口蹄疫重組腺病毒的準備21-24
• 1.3.1 細胞培養(yǎng)21
• 1.3.2 細胞傳代21-22
• 1.3.3 重組腺病毒的擴增22
• 1.3.4 病毒滴度的測定22-24
• 1.4 小鼠免疫試驗（BALB/c 小鼠，來源寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心）24
• 1.5 小鼠免疫 7d 后，觀察如下試驗指標24-26
• 1.5.1 小鼠脾臟分離、眼球采血24
• 1.5.2 單個核細胞的分離24
• 1.5.3 FCM 檢測 Tfh、B 細胞24-25
• 1.5.4 石蠟切片的制備及免疫熒光顯微技術(shù)觀察生發(fā)中心的形成25-26
• 1.6 mRNA 的提取步驟：均在冰上轉(zhuǎn)移細胞26-27
• 1.7 mRNA 跑電泳步驟27
• 1.8 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 步驟27
• 1.9 普通 PCR 步驟27-28
• 1.10 做熒光定量 real-time RT-PCR 步驟28-29
• 1.11 ELISA 操作29-30
• 1.12 統(tǒng)計學(xué)處理30-31
• 2 結(jié)果31-37
• 2.1 FCM 檢測 CXCR5+CD4+T 細胞結(jié)果31-32
• 2.2 FCM 檢測 CXCR5+CD4+PD-1+T 細胞結(jié)果32
• 2.3 FCM 檢測 B220+GL-7+B 細胞結(jié)果32-33
• 2.4 免疫熒光顯微技術(shù) FITC-PNA 染色 100X 顯微鏡下觀察結(jié)果33-34
• 2.5 提取的 mRNA 電泳圖34-35
• 2.6 普通 PCR 摸索退火溫度結(jié)果35
• 2.7 real-time RT-PCR 實驗結(jié)果35
• 2.8 ELISA 實驗結(jié)果35-37
• 3.討論37-42
• 4.小結(jié)42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-51
• 文獻綜述51-60
• 參考文獻56-60
• 致謝60-61
• 發(fā)表論文和參加科研情況61

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