本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染檢測及消毒的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在傳染性疾病的診斷和研究過程中,工作人員需要暴露于傳染性病原微生物,那么極容易造成實驗室感染事件(laboratory acquired infection),從而對工作人員造成職業(yè)傷害。結(jié)核病是十分嚴(yán)重的人類傳染性疾病,其對人類健康、公共衛(wèi)生及社會經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的危害。造成結(jié)核病發(fā)病嚴(yán)重程度與其傳播途徑有關(guān),結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb,生物危害2類)通過空氣中的氣溶膠進(jìn)行傳播,容易造成人群的感染和傳播,其相關(guān)實驗操作需要在BSL-3實驗室內(nèi)進(jìn)行。目前,在結(jié)核病人的診治以及對抗結(jié)核病疫苗及藥物的研究過程中,都需要進(jìn)行分離并培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌,實驗操作人員需要直接與細(xì)菌接觸。文獻(xiàn)報道,實驗人員在進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌操作過程中引起的實驗室獲得性感染發(fā)生幾率較其他病原微生物高。為了降低結(jié)核分枝桿菌實驗人員獲得性感染的發(fā)生幾率,必須嚴(yán)格控制實驗操作過程中的的生物安全。然而,明確實驗過程中結(jié)核分枝桿菌在BSL-3實驗室內(nèi)微環(huán)境中產(chǎn)生的污染程度,并及時對污染環(huán)節(jié)進(jìn)行控制,對污染部位進(jìn)行消毒,是確保實驗室生物安全的基礎(chǔ),對控制實驗室感染的發(fā)生具有重要意義。本論文研究內(nèi)容分為三個部分。首先,在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,針對結(jié)核分枝桿菌基因組DNA差異性區(qū)域(Region of diference),建立BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染監(jiān)測的qPCR檢測方法,包括SYBR Green、TaqMan和qRT-PCR等方法,確立了qPCR檢測的多重檢測指標(biāo)。通過識別M.tb感染動物模型建立實驗活動中BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染的關(guān)鍵部位及環(huán)節(jié),利用已建立監(jiān)測技術(shù)進(jìn)行檢測,基于檢測結(jié)果為實驗人員提出建議和防護(hù)措施,從而降低實驗人員實驗室獲得性感染的風(fēng)險。最后,研究了過氧化氫干霧生物安全柜微環(huán)境表面的消毒效果,通過清除污染有效控制實驗室獲得性M.tb感染的發(fā)生,從而保障BSL-3實驗室生物安全。論文的第一部分研究,在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,建立了結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染監(jiān)測的qPCR檢測方法[13-21]。首先,通過生物信息學(xué)方法對M.tb基因組DNA與BCG和M.S基因組DNA進(jìn)行比對,針對差異區(qū)域RD1、RD4、RD9、RD10和RD12分別設(shè)計特異性引物。然后進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)特異性驗證(PCR和qPCR),最終確定RD9區(qū)為特異性檢測靶點。反應(yīng)特異性及檢測敏感性驗證顯示,RD9區(qū)引物能夠檢測到結(jié)核分枝桿菌模板DNA最低拷貝數(shù)為101/μL。然后,為了在微環(huán)境表面污染的檢測中進(jìn)一步精確qPCR的檢測結(jié)果,針對RD9區(qū)檢測靶點構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測拷貝數(shù)為101。進(jìn)而,在qPCR (SYBR Green)檢測方法的基礎(chǔ)上,在RD9區(qū)檢測區(qū)域構(gòu)建了特異性TaqMan探針(probe A),最低能夠檢測M.tb基因組DNA拷貝數(shù)為102/μL。為了進(jìn)一步確定實驗室微環(huán)境污染M.tb的活性,初步摸索了qRT-PCR的檢測方法,最低可檢測到M.tb RNA拷貝數(shù)為104/gL。最后,研究了污染樣品中DNA的定量與活菌量(CFU值)之間的關(guān)系。應(yīng)用已建立的RD9區(qū)的PCR和qPCR檢測方法,對BSL-3實驗室微環(huán)境表面在開展實驗之前的污染情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示盡管對實驗室進(jìn)行了終末消毒,但在之前實驗過程中某些污染程度較大的部位,仍存在一定的M.tb DNA污染。為了減少這部分DNA對于后續(xù)實驗中實驗室微環(huán)境污染檢測的影響,需要對生物安全柜和培養(yǎng)箱這些部位進(jìn)行去污染處理,使用75%酒精進(jìn)行擦拭從而減少污染DNA的殘留。論文的第二部分檢測了建立結(jié)核分枝桿菌動物模型(小鼠急性感染模型、小鼠呼吸道感染模型、豚鼠皮下注射感染模型)實驗過程中關(guān)鍵污染環(huán)節(jié)和部位的污染風(fēng)險[22-29]。采用已建立的RD9區(qū)PCR和qPCR (SYBR Green)檢測技術(shù),結(jié)合前期建立的RD2區(qū)qPCR 和 PCR檢測技術(shù),監(jiān)測了建立動物感染模型過程中墊料及飼料更換、動物解剖操作以及臟器研磨等實驗操作,檢測了實驗室微環(huán)境中動物飼養(yǎng)籠具、生物安全柜操作面及個人防護(hù)裝備等部位的污染。檢測結(jié)果提示,動物墊料及飼料更換、動物解剖操作過程中檢測部位的污染程度比臟器研磨實驗嚴(yán)重；其中飼養(yǎng)籠具污染最為嚴(yán)重的部位為鼠籠的內(nèi)外側(cè)、飲水瓶和飼料架；生物安全柜污染主要集中實驗操作區(qū)；個人防護(hù)用品污染最為嚴(yán)重的區(qū)域是操作者左右手套手心區(qū)域。因此,提示在進(jìn)行相關(guān)M.tb實驗操作過程中,需要加強(qiáng)該類區(qū)域或部位的防護(hù),并及時進(jìn)行消毒。為了防止M.tb活菌污染引起實驗室獲得性感染,我們檢測了Elispot檢測的小鼠脾細(xì)胞、用于FACS檢測的豚鼠脾細(xì)胞和用于ELISA檢測的豚鼠血清中M.tb活菌殘余。檢測結(jié)果提示,M.tb感染小鼠和豚鼠脾細(xì)胞未經(jīng)甲醛固定時,均存在M.tb活菌殘余,然而經(jīng)過甲醛固定后脾細(xì)胞未檢測到M.tb活菌。豚鼠血清經(jīng)過高速離心后,未檢測到M.tb活菌。論文的第三部分研究了過氧化氫干霧(粒徑小于10um)不同的消毒程序?qū)ι锇踩癖砻娉Ｒ娢⑸锏南拘Ч�。結(jié)果顯示,在生物安全柜內(nèi)采用優(yōu)化的消毒程序(發(fā)散循環(huán)8次,每次1分鐘,達(dá)60 ppm后,靜置消毒2小時。利用該程序,過氧化氫干霧可完全殺滅1×106CFU枯草桿菌芽孢、嗜熱脂肪桿菌芽孢、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、恥垢分枝桿菌以及1×108 CFU大腸埃希菌。然而當(dāng)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、恥垢分枝桿菌微生物濃度達(dá)1×107CFU時,過氧化氫干霧無法完全殺滅微生物。生物安全實驗室微環(huán)境消毒是控制實驗室污染的重要環(huán)節(jié)。過氧化氫廣泛用于病原微生物實驗室微環(huán)境消毒,通過研究建議在進(jìn)行過氧化氫干霧消毒,應(yīng)先用消毒劑處理,以期徹底殺滅生物安全柜微環(huán)境中污染的病原微生物[30-35]。本研究建立了結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染監(jiān)測的qPCR檢測方法,初步明確了感染動物實驗活動中易被感染性氣溶膠污染的區(qū)域,從而為個人防護(hù)及有效的消毒清場提供了依據(jù)；同時驗證了過氧化氫干霧對結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室生物安全柜內(nèi)微環(huán)境的消毒效果。從污染識別、污染控制及污染清除三個方面,有效控制實驗室獲得性M.tb感染的發(fā)生,為結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室生物安全提供保障。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 BSL-3 實驗室 實驗室污染 微環(huán)境污染 檢測 結(jié)核分枝桿菌感染 動物模型 過氧化氫干霧 消毒
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-12
• 第一部分 結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染的檢測方法的建立12-41
• 前言12-13
• 材料與方法13-26
• 結(jié)果26-38
• 一、結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境PCR檢測方法的建立26-28
• 二、結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境定量PCR檢測方法的建立28-34
• 三、結(jié)核分枝桿菌qRT-PCR檢測方法的建立34-35
• 四、結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室實驗活動前微環(huán)境污染的檢測35-38
• 討論38-41
• 第二部分 結(jié)核分枝桿菌感染動物模型建立過程中關(guān)健污染環(huán)節(jié)的研究41-70
• 前言41
• 材料與方法41-54
• 結(jié)果54-64
• 一、在BSL-3實驗室建立結(jié)核分枝桿菌感染動物模型的研究54
• 二、結(jié)核分枝桿菌動物感染模型建立過程中的風(fēng)險識別54-58
• 三、動物感染模型建立過程中實驗室微環(huán)境污染的檢測58-63
• 四、帶離BSL3實驗室感染動物標(biāo)本的M.化活菌檢測63-64
• 討論64-70
• 第三部分 過氧化氫干霧生物安全柜微環(huán)境表面消毒效果的研究70-82
• 前言70
• 材料與方法70-73
• 結(jié)果73-79
• 一、不同程序下過氧化氫干霧殺滅芽孢效果的檢測73-75
• 二、優(yōu)化程序下過氧化氫干霧殺滅不同病原微生物效果的檢測75-79
• 討論79-82
• 論文總結(jié)82-83
• 參考文獻(xiàn)83-89
• 綜述89-100
• 參考文獻(xiàn)98-100
• 附錄100-101
• 致謝101-102

【二級參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌BSL-3實驗室微環(huán)境表面污染檢測及消毒的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：340027