本文關(guān)鍵詞：MD-2模擬肽在RAW264.7細(xì)胞膜上相互作用蛋白的釣取及篩選鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：髓樣分化蛋白-2(myeloid differential protein，MD-2)是Toll樣受體(Toll likereceptors, TLRs)與脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)結(jié)合的受體分子之一，作為天然免疫識別的重要調(diào)控分子，在脂多糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要角色。新近研究認(rèn)為MD-2是LPS活化TLR4跨膜信號通路所必需的受體分子，抑制其對該通路的活化作用是防治LPS誘導(dǎo)的膿毒癥的有效策略。分泌型MD-2(soluble myeloid differential protein2,sMD-2)的遠(yuǎn)距作用已被人們發(fā)現(xiàn)，表明MD-2在細(xì)胞膜上相互作用位點(diǎn)并不是唯一的，尋找新的MD-2的相互作用位點(diǎn)/作用蛋白對于防治內(nèi)毒素誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)具有重要的理論意義和潛在應(yīng)用價值。 項(xiàng)目組在前一個基金項(xiàng)目(No.30700289)研究中基于MD-2結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，設(shè)計(jì)構(gòu)建了1條新的來源于MD-2兩個獨(dú)特的功能結(jié)合域的模擬肽(MD-2mimeticpeptide，MDMP)，其氨基酸序列為：CHGHDDDYSFCFSFEGILFPKGHYR，包括MD-2與TLR4的結(jié)合域(Cys95-Cys105)及MD-2與LPS的結(jié)合域(Phe119-Lys132)，并初步證明MDMP在體外和體內(nèi)可有效地抑制LPS誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)。 在前期研究的基礎(chǔ)上本課題針對MDMP的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，通過9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成了MDMP及其衍生肽：包括用于細(xì)胞定位的FITC-MDMP及用于Pull Down釣取MDMP相互作用位點(diǎn)的6XHis-MDMP，探討其在RAW264.7細(xì)胞膜上的定位特征，并經(jīng)His-Pull Down、Tricine-SDS-PAGE電泳及ESI-Q-TOF質(zhì)譜鑒定，獲取其在RAW264.7細(xì)胞膜上的相互作用蛋白，深入研究MDMP拮抗內(nèi)毒素誘發(fā)的過度炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。 此外，為了進(jìn)一步在人源性巨噬細(xì)胞模型上釣取MDMP的相互作用蛋白，擬用豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)誘導(dǎo)THP-1分化為人源性成熟巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞模型，驗(yàn)證MDMP相互作用蛋白及作用位點(diǎn)在人體細(xì)胞上的效應(yīng)是否一致。鑒于目前通過PMA誘導(dǎo)THP-1分化為成熟巨噬細(xì)胞的方法尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，為建立穩(wěn)定可靠的有利于模擬內(nèi)毒素誘發(fā)過度炎癥的THP-1源性巨噬細(xì)胞模型，，我們對該誘導(dǎo)過程進(jìn)行了部分優(yōu)化，并對PMA在誘導(dǎo)TPH-1成為成熟人源巨噬細(xì)胞的過程中對MD-2的表達(dá)、定位及細(xì)胞因子TNF-α、IL-6分泌的影響進(jìn)行檢測分析，為下一步在人體細(xì)胞上研究MDMP的效應(yīng)和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 主要實(shí)驗(yàn)方法與研究結(jié)果： 1.采用EasyModeller軟件以MD-2為模板，基于同源建模的系統(tǒng)理論原理直觀地獲取MDMP的空間結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行了能量優(yōu)化，初步發(fā)現(xiàn)模擬結(jié)構(gòu)能較好展示MD-2模擬肽（MDMP）的二、三級結(jié)構(gòu)；通過激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal laser scanningmicroscope，CLSM)觀察到FITC-MDMP明確定位在RAW264.7細(xì)胞膜上。 2.通過改進(jìn)和優(yōu)化His-Pull Down實(shí)驗(yàn)技術(shù)條件獲取MDMP在RAW264.7細(xì)胞膜上的相互作用蛋白，Tricine-SDS-PAGE電泳進(jìn)行相互作用蛋白的分離，考馬斯亮藍(lán)染色顯示有差異性條帶；進(jìn)一步經(jīng)ESI-Q-TOF質(zhì)譜鑒定差異條帶蛋白，通過http://www.uniprot.org/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，初步篩選鑒定可能性較大的相互作用蛋白包括CH60(60kDa heat shock protein)，S10A4(Protein S100-A4)，RAB10(Ras-related protein Rab-10)， IRAK2(Interleukin-1receptor-associated kinase-like2)，ILRL1(Interleukin-1receptor-like1)，MSRE (Macrophage scavenger receptor types Iand II)等。 3. PMA梯度劑量(1~100ng/ml)均可成功誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞成熟分化為人源巨噬細(xì)胞，RT-qPCR和Western blot檢測誘導(dǎo)成熟THP-1細(xì)胞源巨噬細(xì)胞MD-2mRNA及蛋白表達(dá)量較誘導(dǎo)前均顯著升高(P0.01)，ELISA檢測THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α、IL-6分泌水平隨PMA誘導(dǎo)濃度依次顯著增加(P0.01)，sMD-2僅誘導(dǎo)前后有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)；激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MD-2分布，發(fā)現(xiàn)PMA誘導(dǎo)后MD-2蛋白表達(dá)較誘導(dǎo)前顯著增加，誘導(dǎo)劑量組之間無顯著差異。 主要結(jié)論： 1.同源建模的系統(tǒng)理論構(gòu)建出MDMP有其獨(dú)特的二、三級空間構(gòu)象，可為后續(xù)相互作用位點(diǎn)的研究提供理論依據(jù)；激光共聚焦掃描顯微鏡準(zhǔn)確展示了MDMP在小鼠源性巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞膜上的定位特征。 2.改進(jìn)和優(yōu)化的His-Pull Down實(shí)驗(yàn)結(jié)合Tricine-SDS-PAGE電泳分離差異條帶及ESI-Q-TOF質(zhì)譜篩選鑒定，成功獲取到MDMP在RAW264.7細(xì)胞膜上的相互作用蛋白，表明MDMP拮抗內(nèi)毒素誘導(dǎo)的過度炎癥的作用位點(diǎn)并不單一，可能存在多個作用蛋白位點(diǎn)和多種作用方式。 3.低濃度劑量(1ng/ml)PMA即能有效的建立人源性THP-1巨噬細(xì)胞模型，對巨噬細(xì)胞膜受體MD-2等的結(jié)構(gòu)性表達(dá)無明顯影響，且不會增加炎癥因子TNF-α、IL-6的基礎(chǔ)分泌水平，有利于MDMP拮抗內(nèi)毒素效應(yīng)及其機(jī)制研究。
【關(guān)鍵詞】：巨噬細(xì)胞 髓樣分化蛋白-2 MD-2模擬肽 相互作用蛋白 His-Pull Down實(shí)驗(yàn) 質(zhì)譜分析 誘導(dǎo)分化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 氨基酸英文縮簡寫一覽表6-7
• Abstract7-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 MDMP 在 RAW264.7 細(xì)胞膜上相互作用蛋白的釣取及篩選鑒定15-40
• 2.1 MDMP 及相關(guān)肽的設(shè)計(jì)構(gòu)建與合成15-22
• 2.1.1. 材料與方法16-17
• 2.1.2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-22
• 2.2 MDMP 在 RAW264.7 細(xì)胞上的形態(tài)學(xué)定位22-24
• 2.2.1. 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.2.2. 實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 2.2.3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24
• 2.3 MDMP 在 RAW264.7 細(xì)胞膜上相互作用蛋白釣取及分離24-33
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 2.3.3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 2.4 MDMP 在 RAW264.7 胞膜上相互作用蛋白質(zhì)譜鑒定33-37
• 2.4.1. 實(shí)驗(yàn)方法與步驟33-34
• 2.4.2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-37
• 2.5 討論37-40
• 第三章 PMA 對 THP-1 源巨噬細(xì)胞膜表面受體 MD-2 表達(dá)的影響40-51
• 3.1. 材料與儀器41-42
• 3.2. 實(shí)驗(yàn)方法42-46
• 3.3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-49
• 3.4 討論49-51
• 全文結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 文獻(xiàn)綜述 髓樣分化蛋白-2 的相關(guān)研究綜述56-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的文章64-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

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1 閆紅;靶向MD-2抗炎多肽的篩選及其對TLR4活化的阻抑作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

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本文編號：339774