發(fā)布時間：2017-04-30 04:17

  本文關(guān)鍵詞：高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗體及表位鑒定和索瑞酶相互作用蛋白的篩選鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本論文由兩部分內(nèi)容組成：第一部分是對高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗體及表位的鑒定；第二部分是索瑞酶(Thorase)相互作用蛋白的篩選與鑒定。 高致病性禽流感病毒H5N1,屬于甲型流感病毒,主要在禽類之間相互傳播,導(dǎo)致數(shù)以百萬計的家禽死亡。1997年在中國香港發(fā)生了全球首例人感染禽流感事件,引起了廣泛關(guān)注,提示禽流感病毒有可能已突破物種間屏障,獲得了直接感染人的能力。目前,雖然無確鑿證據(jù)證明禽流感病毒可以在人群之間進行直接相互傳播,然而,有文獻報道,經(jīng)過多次傳代或者點突變的高致病性禽流感病毒H5N1能夠在哺乳動物雪貂之間進行直接相互傳播。因此,高致病性禽流感病毒H5N1對人類健康的可能威脅不容忽視。 H5N1病毒借助其包膜表面的血凝素(hemagglutinin, HA)與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合而感染宿主細(xì)胞。同時,HA也是宿主產(chǎn)生中和抗體的重要靶抗原。在抵抗高致病性禽流感H5N1病毒感染的免疫中,中和抗體能有效地阻斷病毒感染及清除病毒已感染的細(xì)胞,是機體體液免疫應(yīng)答的重要執(zhí)行分子。因此,尋找H5N1的中和抗原表位是禽流感病毒中和抗體制備及免疫治療研究的重要前提。 本課題組前期對四株H5N1病毒的HA基因,即香港(人)株A/Hongkong/213/03H5N1HA (HK-HA)、安徽(人)株A/Anhui/01/05H5N1HA (AH-HA)、新疆(人)株A/Xinjiang/01/06H5N1HA (XJ-HA)和青海(禽)株A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05H5N1HA (QH-HA)進行了分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)分析證明,這些毒株涵蓋了在中國境內(nèi)流行的高致病性禽流感H5N1病毒的主要分枝。同時,利用抗HA的中和抗體篩選得到了6個HA候選中和抗原表位。 為進一步驗證所篩選的HA候選中和抗原表位,本研究對6條多肽表位進行分析,利用表面線性表位抗體庫(Surface Epitope Antibody Library, SEAL)技術(shù)表達(dá)多表位串聯(lián)肽作為免疫原制備表位肽單克隆抗體,在H5N1假病毒水平和重組蛋白水平再次篩選鑒定,以獲得針對單一表位的中和抗體。 為此,首先將候選的6條多肽氨基酸序列串聯(lián)組合形成4條肽鏈,通過搭橋PCR方法和人工合成DNA方法獲得了4條多表位肽(poly-epitope peptide, PEG)編碼基因片段,然后連接到一種免疫增強載體,構(gòu)建原核表達(dá)載體。采用大腸桿菌表達(dá)純化重組多表位肽作為免疫原制備單克隆抗體,共獲得了23株分泌高親合力單克隆抗體。 隨后,包裝了5株高致病性禽流感H5N1假病毒,分別通過微量中和實驗篩選具有高效中和活性的單克隆抗體；采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化重組HA,通過免疫印跡實驗驗證中和抗體識別并結(jié)合的蛋白；利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)鑒定中和抗體劑量依賴性結(jié)合多肽。 最后,從獲得的23株單克隆抗體中,分離純化出10株亞型為IgG的單克隆抗體,其中3株單克隆抗體對4株不同來源的H5N1假病毒具有高效的中和活性,并且均能與4種不同分枝的重組HA結(jié)合。HA144-153和154-163兩個氨基酸區(qū)域的合成肽,能夠被中和抗體識別,且其結(jié)合作用具有劑量依賴性,這提示,這兩個區(qū)域為HA的中和抗原表位,為研制表位疫苗及抗體治療奠定基礎(chǔ)。 本文第二部分是篩選并鑒定與索瑞酶(Thorase)相互作用的蛋白。索瑞酶(Thorase)屬于AAA+(ATPases Associated with diverse cellular Activities, AAA)ATP水解酶家族成員,是通過一種功能性篩選策略發(fā)現(xiàn)的對神經(jīng)元具有保護作用的新蛋白。本課題組前期采用蛋白芯片高通量篩選出375個與Thorase相互作用的蛋白,并對這些蛋白進行分類分析。本研究在蛋白芯片的結(jié)果中挑選出37個本課題組感興趣的蛋白分子,然后采用GatewayTM技術(shù)構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽的重組靶蛋白載體,分別將含有GFP標(biāo)簽的靶蛋白質(zhì)粒與Thorase載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,用特殊的GFP抗體偶聯(lián)的瓊脂糖珠捕獲GFP融合蛋白,免疫共沉淀方法驗證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有11個蛋白與Thorase相互作用。該研究為進一步闡明Thorase的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：H5N1禽流感 血凝素 假病毒 中和抗體 索瑞酶 免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 目錄3-4
• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英文縮略詞表9-11
• 第一部分 高致病性禽流感H5N1病毒血凝素中和抗體及表位的鑒定11-33
• 前言11-12
• 實驗材料12-18
• 實驗方法18-26
• 實驗結(jié)果26-31
• 討論31-33
• 第二部分 索瑞酶相互作用蛋白的篩選與鑒定33-48
• 前言33-35
• 實驗材料35-38
• 實驗方法38-43
• 實驗結(jié)果43-47
• 討論47-48
• 參考文獻48-52
• 綜述：AMPA受體在突出可塑性中的研究進展52-62
• 參考文獻57-62
• 個人簡歷62-63
• 致謝63-64

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1 楊t熈，

本文編號：336235