發(fā)布時間：2017-04-30 05:01

  本文關鍵詞：鼠瘧原蟲TatD-like DNase序列的表達與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：瘧疾是由瘧原蟲引起并經(jīng)蚊蟲傳播的一種重要的寄生蟲病，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。它和艾滋病及結核病一起被認為是對人類危害最嚴重的傳染病。瘧原蟲的免疫逃避機制十分復雜，這也正是導致瘧疾疫苗研究困難的原因之一。對惡性瘧疾的主要病理組織研究發(fā)現(xiàn)，在有大量惡性瘧原蟲蟲體聚集的地方，卻沒有明顯的類似于細菌或病毒感染時引發(fā)的炎癥反應，巨噬細胞和其它淋巴細胞的聚集基本上和正常組織相類似，并且很少有嗜中性粒細胞出現(xiàn)。這表明，，瘧原蟲可能具有拮抗宿主天然免疫的作用。在機體固有免疫應答中，最新研究發(fā)現(xiàn)了中性粒細胞抵御病原微生物的另一種新機制：它們在被稱為NETosis的一種主動性死亡過程中將染色質(zhì)及胞漿內(nèi)的溶酶體顆粒一起釋放到胞外，形成網(wǎng)狀結構（neutrophil extracellular traps (NETs)）以捕獲并殺死病原微生物，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌、原生動物和病毒。病原微生物可通過分泌一種DNase來降解這種NETs結構的骨架分子DNA，破壞NETs對病原微生物的作用，進而逃避宿主的先天性免疫清除。DNase是病原微生物逃避NETs攻擊的有效武器，與病原微生物的毒力強弱相關。目前認為DNase是病原生物的重要毒力/致病相關因子。對幾種瘧原蟲基因組分析結果表明，瘧原蟲基因組中編碼的TatD-like DNase在各種瘧原蟲中序列非常保守，且它們的N-末端均含有一個信號肽序列。在空間結構上與大腸桿菌的TatD DNase非常接近，而TatD DNase在大腸桿菌中是一種具有降解DNA活性的蛋白質(zhì)。由此推測，瘧原蟲可分泌表達一種具有DNA酶活性的蛋白質(zhì)分子TatD-like DNase。本研究的目的是對TatD-like DNase在三種鼠瘧原蟲中的表達情況進行鑒定，研究該蛋白質(zhì)與瘧原蟲致病的相關性。 本研究首先對本實驗室保存的重組質(zhì)粒pUC19-PCH、pUC19-PB和pUC19-PY分別用BamHI和XhoI進行雙酶切，得到目的片段PCH、PB和PY。將目的片段分別克隆到pET-28a和pGEX-4T-1表達載體中，構建重組表達質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化基因工程菌E.coli BL21。誘導表達后，利用親和層析的方法純化獲得了三個His標簽重組蛋白質(zhì)和三個GST標簽重組蛋白質(zhì)。經(jīng)Western-blot分析，重組蛋白質(zhì)His-PCH、His-PB、GST-PCH和GST-PB的分子量大小與軟件預測值一致，而His-PY和GST-PY重組蛋白質(zhì)的分子量較預測值偏小約4kDa。 利用純化獲得的His標簽重組蛋白質(zhì)作為抗原，與弗氏佐劑乳化后免疫家兔。ELISA法檢測血清效價達1：16000后，通過心臟采血，收集抗血清。利用Protein A親和層析的方法純化獲得了高純度的特異性抗體IgG，以用于對三種鼠瘧原蟲TatD-like DNase表達情況的Western-blot和間接免疫熒光分析。 每只Balb/c小鼠腹腔注射1×105感染瘧原蟲的紅細胞。當小鼠紅細胞染蟲率達50%以上時，摘除眼球采血，收集血細胞。利用含0.1%Saponin的PBS裂解紅細胞，離心，收集蟲體。利用Western-blot對染蟲紅細胞和蟲體樣品進行分析，一抗為本實驗制備的抗TatD-like DNase的IgG，二抗為堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG。結果顯示，在染蟲紅細胞和蟲體樣品的泳道均檢測有特異性條帶，陰性對照沒有，這表明P.chabaudi chabaudi AS、P.bergher NK65和P.yoelii YM均表達TatD-like DNase蛋白質(zhì)。此結果同時表明了，本實驗制備的多克隆抗體能夠特異性地識別蟲體表達的TatD-like DNase分子。當小鼠紅細胞染蟲率達10%時，經(jīng)尾尖采血制片，用4%多聚甲醛固定紅細胞，以實驗制備的抗TatD-like DNase IgG為一抗，以Alexa Fluor488山羊抗兔IgG為二抗，進行間接免疫熒光分析。結果顯示，在納蟲泡內(nèi)和染蟲紅細胞周圍均能觀察到特異性綠色熒光，陰性對照沒有，這表明TatD-like DNase在三種鼠瘧原蟲中確有表達且可分泌到蟲體外。本研究為進一步研究TatD-like DNase的功能及其與蟲體致病的相關性奠定了基礎，同時也為新型抗瘧藥物和高效瘧疾疫苗的研發(fā)奠定了基礎。
【關鍵詞】：重組蛋白質(zhì) 多克隆抗體 TatD-like DNase 鼠瘧原蟲
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R382.31
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-14
• 第一篇 文獻綜述14-24
• 第1章 瘧原蟲免疫逃避機制研究進展14-24
• 1.1 瘧原蟲與瘧疾的概述14-16
• 1.2 瘧原蟲的免疫逃避機制16-22
• 1.3 展望22-24
• 第二篇 研究內(nèi)容24-71
• 第1章 鼠瘧原蟲 TatD-like DNase 序列的原核表達及純化24-49
• 1.1 材料24-28
• 1.2 方法28-37
• 1.3 結果37-45
• 1.4 討論45-48
• 1.5 小結48-49
• 第2章 抗 TatD-like DNase 多克隆抗體的制備49-58
• 2.1 材料49-51
• 2.2 方法51-54
• 2.3 結果54-56
• 2.4 討論56-57
• 2.5 小結57-58
• 第3章 TatD-like DNase 在三種鼠瘧原蟲中表達情況的鑒定58-71
• 3.1 材料58-59
• 3.2 方法59-62
• 3.3 結果62-68
• 3.4 討論68-70
• 3.5 小結70-71
• 結論71-72
• 參考文獻72-80
• 導師簡介80-81
• 作者簡介81-82
• 致謝82

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王憲鋒,薛采芳,甄榮芳;惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白 1在瘧原蟲免疫逃避中的作用[J];地方病通報;2000年02期

2 賈默稚,高興政;惡性瘧原蟲的抗原變異與var基因家族[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);1999年03期

3 王小環(huán);楊蓮如;趙林立;吳紹強;;免疫熒光檢測技術及其在寄生蟲檢測中的應用進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2012年03期

4 張小霞,嚴衛(wèi)星,徐海濱;外源蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)類型的研究進展[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);2004年04期

5 王娜;惡性瘧原蟲的基因表達水平對密碼子使用的影響[J];國外醫(yī)學(寄生蟲病分冊);2005年01期

6 高艷利;楊思文;樊凱奇;陳靜;王娟;;SDS-PAGE電泳技術分析蛋白質(zhì)的研究[J];遼寧化工;2007年07期

7 肖丹;龍泳;王善青;;國內(nèi)外瘧疾疫情的研究進展[J];中國熱帶醫(yī)學;2010年01期

8 李節(jié);何永蜀;楊照青;;惡性瘧原蟲var基因相關研究新進展[J];熱帶醫(yī)學雜志;2009年02期

9 車河龍;林棟;;瘧疾的防控現(xiàn)狀及進展[J];熱帶醫(yī)學雜志;2010年02期

10 王宇;沈玉棟;雷紅濤;劉文字;王弘;孫遠明;;免疫分析標記技術研究進展[J];食品工業(yè)科技;2007年10期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 杜承;惡性瘧原蟲Pf332抗原的免疫原性分析[D];吉林大學;2010年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張娜;惡性瘧原蟲轉(zhuǎn)錄因子的克隆表達及多克隆抗體的制備[D];吉林大學;2009年

  本文關鍵詞：鼠瘧原蟲TatD-like DNase序列的表達與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：336264