本文關(guān)鍵詞：基因工程法構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乳糖酶又稱β-半乳糖苷酶,可以催化水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用。乳糖酶作為一種生物酶制劑,主要用來治療乳糖不耐受癥,處理加工乳制品等,在醫(yī)藥、食品等諸多領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。但目前乳糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)還存在許多問題,如：乳糖酶的單位產(chǎn)量較低；多為胞內(nèi)酶,純化工藝復(fù)雜,應(yīng)用成本高；適用范圍較窄,對環(huán)境要求高等。其中米曲霉乳糖酶因其酶學(xué)性質(zhì)好、可胞外分泌、商業(yè)化應(yīng)用多、表達(dá)水平低等特點,被本文選為研究對象。 本研究首次將米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體中,實現(xiàn)該乳糖酶的有效分泌和高效表達(dá)。以米曲霉cDNA文庫為模板,通過PCR擴增得到米曲霉乳糖酶基因cDNA,序列長度為3015bp。根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性對該乳糖酶基因進(jìn)行了優(yōu)化,成功提高了其密碼子的使用頻率,去除了不利于轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的稀有密碼子。然后連入GAP系列的表達(dá)載體構(gòu)建基因工程菌株,該系列載體所用的GAP啟動子作為組成型啟動子,不需要其他畢赤酵母工程菌中常用的甲醇誘導(dǎo)步驟,在食品安全上有效避免了因甲醇使用所帶來的問題。經(jīng)過藍(lán)白斑初篩及活性測定復(fù)篩最終得到了一株高產(chǎn)乳糖酶基因工程菌株GalC131。該菌株可高效地將乳糖酶蛋白分泌到胞外,無需破碎細(xì)胞,雜蛋白很少,后續(xù)純化工藝簡單,經(jīng)超濾和凝膠層析后,可直接用于牛奶中乳糖水解。 本研究對畢赤酵母工程菌GalC131發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、金屬離子和pH、溫度、接種量等發(fā)酵條件分別進(jìn)行了單因素優(yōu)化,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖45g/L、甘油15g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物20g/L、MgSO4·7H2O9g/L、FeSO4·7H2O60mg/L、CuSO4·5H2O6mg/L、K2HPO44g/L、CaSO40.93g/L、 K2SO418.2g/L、微量元素液1mL/L,發(fā)酵條件為pH7、30℃、接種量6%,300r/min。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶酶活可達(dá)到672U/mL,較優(yōu)化前提高了30.7%。在1L發(fā)酵罐中對碳源流加速率進(jìn)行了優(yōu)化,采用15mL/h-L在發(fā)酵16h后開始流加,并將發(fā)酵工藝在50L發(fā)酵罐中成功進(jìn)行了中試放大,乳糖酶酶活達(dá)到4312U/mL,大大高于目前國內(nèi)外報道的乳糖酶產(chǎn)量。 本研究對GalCl31所產(chǎn)的重組米曲霉乳糖酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,并以原始米曲霉乳糖酶作為對照。重組酶的最適pH為5.2,并在pH4.6-8.0之間保持穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度60℃,熱穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性等都優(yōu)于對照酶,酶學(xué)性質(zhì)表現(xiàn)更好。 本研究還通過HPLC檢測該乳糖酶在不同條件下對牛奶中乳糖的水解率,初步研究了其在制備低乳糖牛奶中的使用條件。在37℃、3000U/mL酶液0.3%的添加量條件下,乳糖水解率能達(dá)94%以上。同時該乳糖酶在低溫條件下也具有良好的乳糖水解率,10℃(0.9%)水解率可達(dá)83%以上,25℃(0.9%)可達(dá)93%以上,有利于在乳制品生產(chǎn)中避免微生物腐敗,保持牛奶新鮮度,降低生產(chǎn)成本。 綜上所述,本研究通過基因工程方法成功開發(fā)了一種產(chǎn)量高、可胞外分泌、后續(xù)純化簡單、生產(chǎn)過程安全、酶學(xué)性質(zhì)好、低溫表現(xiàn)良好的新型乳糖酶,為乳糖酶在食品等工業(yè)上的進(jìn)一步大規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：乳糖酶 米曲霉 畢赤酵母 pGAPZα載體 基因工程 發(fā)酵優(yōu)化 低乳糖牛奶
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• CATALOG7-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 主要符號說明14-15
• 第一章 研究背景15-27
• 1.1 乳糖酶的結(jié)構(gòu)與作用機制15-16
• 1.2 不同來源乳糖酶的酶學(xué)性質(zhì)16-19
• 1.2.1 細(xì)菌來源的乳糖酶18
• 1.2.2 酵母菌來源的乳糖酶18
• 1.2.3 霉菌來源的乳糖酶18-19
• 1.3 產(chǎn)乳糖酶微生物的改造19-20
• 1.4 乳糖酶的應(yīng)用20-22
• 1.4.1 治療乳糖不耐癥20
• 1.4.2 提高乳制品質(zhì)量20
• 1.4.3 應(yīng)用于發(fā)酵乳制品20-21
• 1.4.4 應(yīng)用于乳清的處理與綜合應(yīng)用21
• 1.4.5 應(yīng)用于生產(chǎn)低聚半乳糖21
• 1.4.6 在分子生物學(xué)中的應(yīng)用21-22
• 1.5 斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)22-26
• 1.5.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點22
• 1.5.2 常用畢赤酵母宿主菌22-23
• 1.5.3 常用畢赤酵母表達(dá)載體和元件23-24
• 1.5.4 影響畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的因素24-26
• 1.6 本研究的目的和意義26-27
• 第二章 米曲霉乳糖酶的克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá)27-46
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 菌株與載體27
• 2.1.2 試劑27
• 2.1.3 培養(yǎng)基27-28
• 2.1.4 儀器28
• 2.2 方法28-37
• 2.2.1 米曲霉乳糖酶基因的提取28-32
• 2.2.2 米曲霉乳糖酶基因序列的分析與優(yōu)化32
• 2.2.3 乳糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)32-35
• 2.2.4 乳糖酶活性的測定35-37
• 2.3 結(jié)果與討論37-45
• 2.3.1 米曲霉RNA的提取37
• 2.3.2 米曲霉乳糖酶的克隆37-38
• 2.3.3 乳糖酶基因序列分析38
• 2.3.4 乳糖酶基因序列優(yōu)化38-41
• 2.3.5 乳糖酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建41-42
• 2.3.6 制備畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞42
• 2.3.7 重組酵母的構(gòu)建及驗證42-43
• 2.3.8 目的蛋白的表達(dá)測定43-45
• 2.4 本章小結(jié)45-46
• 第三章 畢赤酵母工程菌產(chǎn)乳糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化46-58
• 3.1 材料46-47
• 3.1.1 菌株46
• 3.1.2 試劑46
• 3.1.3 培養(yǎng)基46
• 3.1.4 儀器46-47
• 3.2 方法47-49
• 3.2.1 乳糖酶活力的測定47
• 3.2.2 菌株活化與初篩47
• 3.2.3 碳源對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗47
• 3.2.4 碳源濃度對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗47-48
• 3.2.5 氮源對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗48
• 3.2.6 氮源濃度對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗48
• 3.2.7 無機鹽離子濃度對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗48
• 3.2.8 發(fā)酵條件對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗48
• 3.2.9 碳源流加速度對乳糖酶發(fā)酵的影響試驗48-49
• 3.2.10 50L發(fā)酵中試49
• 3.3 結(jié)果與討論49-57
• 3.3.1 碳源對乳糖酶發(fā)酵的影響49-50
• 3.3.2 碳源濃度對乳糖酶發(fā)酵的影響50-51
• 3.3.3 氮源對乳糖酶發(fā)酵的影響51-52
• 3.3.4 氮源濃度對乳糖酶酶活的影響52-53
• 3.3.5 無機鹽離子對乳糖酶酶活的影響53-54
• 3.3.6 發(fā)酵條件對乳糖酶發(fā)酵的影響54-55
• 3.3.7 碳源流加速度對乳糖酶發(fā)酵的影響55-57
• 3.3.8 50L中試發(fā)酵分析57
• 3.4 本章小結(jié)57-58
• 第四章 重組乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)的研究58-66
• 4.1 材料58
• 4.1.1 材料58
• 4.1.2 試劑與溶液58
• 4.1.3 儀器58
• 4.2 方法58-59
• 4.2.1 乳糖酶活力的測定58-59
• 4.2.2 乳糖酶樣品的純化與制備59
• 4.2.3 最適pH、pH穩(wěn)定性的測定59
• 4.2.4 最適溫度、熱穩(wěn)定性的測定59
• 4.2.5 金屬離子及化學(xué)試劑對乳糖酶的影響59
• 4.3 結(jié)果與討論59-64
• 4.3.1 乳糖酶樣品的純化與制備59-61
• 4.3.2 最適pH、pH穩(wěn)定性的測定61-62
• 4.3.3 最適溫度、熱穩(wěn)定性的測定62-64
• 4.3.4 金屬離子及化學(xué)試劑的影響64
• 4.4 本章小結(jié)64-66
• 第五章 乳糖酶水解新鮮牛奶中乳糖的應(yīng)用效果研究66-72
• 5.1 材料66
• 5.1.1 材料與試劑66
• 5.1.2 儀器66
• 5.2 方法66-67
• 5.2.1 乳糖酶活力的測定66
• 5.2.2 乳糖酶制劑的制備66
• 5.2.3 低乳糖牛奶的制備66-67
• 5.2.4 牛奶中乳糖含量的測定67
• 5.2.5 乳糖水解率的計算67
• 5.3 結(jié)果與討論67-70
• 5.3.1 乳糖酶制劑的制備67
• 5.3.2 牛奶中乳糖含量的測定67-69
• 5.3.3 在37℃條件下的乳糖水解率69
• 5.3.4 在10℃和25℃條件下乳糖酶不同添加量對乳糖水解率的影響69-70
• 5.3.5 低乳糖牛奶的感官表現(xiàn)70
• 5.4 本章小結(jié)70-72
• 總結(jié)72-75
• 參考文獻(xiàn)75-85
• 致謝85-86
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄86-87
• 附表87

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏青;;快速診斷不耐乳糖癥試驗有望成功[J];國外醫(yī)學(xué)情報;2003年09期

2 王政;馬文麗;鄭文嶺;;乳糖酶基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J];海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2009年02期

3 王政;莫菁蓮;黃冬愛;王小英;;乳糖酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)與純化[J];中國熱帶醫(yī)學(xué);2010年05期

4 何偉,黃承鈺;BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及其cDNA探針的制備[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2005年06期

5 張曉宏;孫長顥;;基因多態(tài)性與乳糖不耐癥[J];營養(yǎng)健康新觀察;2004年04期

6 楊春;馬曉強;何蘭杰;張東;王立斌;楊銀學(xué);;大腸癌與乳糖酶基因C/T-13910單核苷酸多態(tài)性相關(guān)性分析[J];寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2008年05期

7 何偉;;乳糖不耐受分子機制研究進(jìn)展[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2006年03期

8 韓石;;基因工程[J];濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1986年01期

9 于萬龍;表達(dá)流感病毒血凝素糖蛋白的不同真核細(xì)胞載體的比較[J];國際生物制品學(xué)雜志;1985年04期

10 宋惠雯;王承黨;;乳糖酶缺乏基礎(chǔ)研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2008年12期

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 王涵犀;有了乳糖酶 牛奶好消化[N];科技日報;2002年

2 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 張偉 博士;生產(chǎn)低聚半乳糖[N];中國食品質(zhì)量報;2003年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 徐金利;產(chǎn)乳糖酶酵母菌株的遺傳改良和乳糖酶的發(fā)酵生產(chǎn)[D];中國海洋大學(xué);2012年

2 何偉;長期多代飲奶對鼠小腸乳糖酶活性及mRNA水平的影響研究[D];四川大學(xué);2004年

3 張偉;利用生物技術(shù)開發(fā)一種新乳糖酶及其高效生產(chǎn)途徑[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2002年

4 王凌云;PiggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的嗜熱菌β-糖苷酶轉(zhuǎn)基因牛研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 賀軍棟;占族人群Y染色體研究及藏族人群乳糖耐受遺傳基礎(chǔ)研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 宋春麗;耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株乳糖酶的研究[D];中國海洋大學(xué);2010年

2 曹少偉;乳糖酶固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化及其分離純化的研究[D];天津科技大學(xué);2010年

3 章沙沙;β-半乳糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

4 侯重文;基因工程法構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究[D];山東大學(xué);2014年

5 宋禮;復(fù)合誘變亮白曲霉篩選高產(chǎn)乳糖酶菌株[D];蘭州大學(xué);2010年

6 王雙輝;耐熱乳糖酶的分泌表達(dá)研究[D];江南大學(xué);2011年

7 楊萍;通過定點突變提高米曲霉乳糖酶的熱穩(wěn)定性的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2010年

8 曹宇婷;UAS重復(fù)對脆壁克魯維酵母乳糖酶基因表達(dá)的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

9 聶春明;乳酸桿菌β-半乳糖苷酶重疊基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 高秀容;乳糖酶的基因克隆[D];西華大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：基因工程法構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：336206