本文關(guān)鍵詞：JMJD5相互作用蛋白的鑒定和N端功能的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：JMJD5(又稱KDM8)是JmjC結(jié)構(gòu)域蛋白家族的一員。最新研究表明它可能在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、胚胎發(fā)育、破骨細(xì)胞分化以及生物鐘節(jié)律調(diào)節(jié)中都有重要作用。JMJD5被報(bào)道具有去甲基酶及羥基化酶的功能,但目前關(guān)于其作用底物及調(diào)控機(jī)制的研究還十分有限。同時(shí),JMJD5的JmjC結(jié)構(gòu)域位于C末端(270-416),僅占全長(zhǎng)的1/3,而其N端(占全長(zhǎng)的2/3)大片區(qū)域的結(jié)構(gòu)和功能仍然未知。為深入研究JMJD5的生物學(xué)功能,我們首先運(yùn)用免疫共沉淀(Co-IP)聯(lián)合質(zhì)譜的檢測(cè)方法成功鑒定了38個(gè)與JMJD5有相互作用的蛋白,功能涉及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA加工、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、凋亡等多個(gè)方面,說(shuō)明JMJD5可能參與了更廣泛的細(xì)胞內(nèi)分子事件。在這些相互作用蛋白中,我們還發(fā)現(xiàn)了核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子Importin β和transportin-1。進(jìn)一步研究表明JMJD5的N端含有經(jīng)典的核定位信號(hào)(NLS)(152-170),可被Importin α/β核轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)識(shí)別,其N端的134-152區(qū)域又能與核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白transportin-1相互作用,兩者共同介導(dǎo)了JMJD5在細(xì)胞內(nèi)的核定位過(guò)程。而JMJD5的核定位功能更被發(fā)現(xiàn)是其能促進(jìn)Cyclin Al表達(dá)的必要條件。此外,我們還發(fā)現(xiàn)JMJD5的N端含有一個(gè)出核信號(hào)(NES)(34-38),受轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CRM-1的調(diào)節(jié)介導(dǎo)其出核。在對(duì)JMJD5相互作用蛋白的研究中,我們還發(fā)現(xiàn)JMJD5可與抑癌蛋白p53發(fā)生直接的相互作用。深入研究表明JMJD5的N端可與p53的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD結(jié)構(gòu)域)相互作用,抑制p53的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而抑制p53靶基因DKN1A等的轉(zhuǎn)錄激活。在DNA損傷時(shí),JMJD5與p53的相互作用減弱,與染色質(zhì)的結(jié)合也明顯減弱,提示JMJD5在DNA損傷反應(yīng)中可能扮演重要角色。本研究對(duì)JMJD5的相互作用蛋白及其N端功能進(jìn)行了深入解析,將為我們?nèi)胬斫釰MJD5在細(xì)胞內(nèi)的功能及調(diào)控機(jī)制提供重要線索和依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：JMJD5 核定位 p53 DNA損傷
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R363
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 縮略語(yǔ)9-12
• 1 引言12-16
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法16-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-20
• 2.1.1 細(xì)胞系16
• 2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)試劑16
• 2.1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑16
• 2.1.4 細(xì)胞處理化學(xué)物16
• 2.1.5 細(xì)胞蛋白提取相關(guān)試劑16-17
• 2.1.6 Western blot相關(guān)試劑17
• 2.1.7 抗體17-18
• 2.1.8 融合蛋白純化試劑18
• 2.1.9 分子克隆及熒光定量PCR試劑18
• 2.1.10 SiRNA及PCR引物18-20
• 2.1.11 軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-30
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、SiRNA干擾、Adr、LBM、MN-NG處理細(xì)胞20-21
• 2.2.2 酸抽提法提取組蛋白21
• 2.2.3 提取細(xì)胞核小體21
• 2.2.4 ANTI-FLAG M2 Magnetic Beads免疫共沉淀、抗體免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)21-22
• 2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)22-24
• 2.2.6 原核蛋白表達(dá)純化24-26
• 2.2.7 體外去甲基反應(yīng)26
• 2.2.8 免疫熒光26-27
• 2.2.9 定點(diǎn)突變27-28
• 2.2.10 PCR28-29
• 2.2.11 染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)29
• 2.2.12 染色質(zhì)結(jié)合與分離組份蛋白的提取29-30
• 3 結(jié)果30-53
• 3.1 JMJD5相互作用蛋白的質(zhì)譜鑒定30-33
• 3.2 JMJD5細(xì)胞內(nèi)核定位機(jī)制的研究33-43
• 3.2.1 JMJD5核定位的過(guò)程依賴于Importin α/β和Transportin-1通路33-35
• 3.2.2 Importin α和Transportin-1作用于JMJD5的不同區(qū)域35-36
• 3.2.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確核定位序列(NLS)的位置及功能36-38
• 3.2.4 JMJD5核定位信號(hào)(NLS)上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的鑒定38-40
• 3.2.5 JMJD5的N端存在出核信號(hào)(NES)40-41
• 3.2.6 核定位功能是JMJD5調(diào)控cyclinA1表達(dá)所必需的41-43
• 3.3 JMJD5與p53的相互作用及在DNA損傷反應(yīng)中的功能研究43-53
• 3.3.1 JMJD5與p53相互作用及關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域的鑒定43-46
• 3.3.2 JMJD5與p53相互作用在DNA損傷后減弱46-48
• 3.3.3 siRNA干擾JMJD5表達(dá)使得p53的靶基因表達(dá)上調(diào)48-50
• 3.3.4 JMJD5可抑制p53對(duì)靶基因CDKN1A的轉(zhuǎn)錄激活50-53
• 4 討論53-57
• 5 結(jié)論和展望57-59
• 5.1 主要結(jié)論57
• 5.2 展望57-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 綜述63-84
• 參考文獻(xiàn)73-84
• 作者簡(jiǎn)歷及在學(xué)期間取得的科研成果84

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：336061