本文關(guān)鍵詞：人源GM-CSF、IL-4基因串聯(lián)共表達(dá)重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 本課題以人白細(xì)胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4, IL-4），粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)為模型細(xì)胞因子,建立并優(yōu)化人源性細(xì)胞因子的組合，并在真核細(xì)胞中穩(wěn)定性表達(dá)重組蛋白及其活性研究，這為多細(xì)胞因子在體外能夠共同表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)素材和理論參考。構(gòu)建人GM-CSF、IL-4基因各自獨(dú)立和經(jīng)IRES元件串聯(lián)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、 pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，轉(zhuǎn)染細(xì)胞并經(jīng)過(guò)連接免疫熒光（indirectimmunofluorescence assay， IFA）及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）檢測(cè)其表達(dá)活性，為構(gòu)建永久表達(dá)細(xì)胞系做準(zhǔn)備，同時(shí)人源細(xì)胞因子的體外表達(dá)及其誘生DC/CIK培養(yǎng)試劑盒的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 方法 1.引物和質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)GenBank上已經(jīng)公布了的人源性GM-CSF、IL-4基因的參考序列。分別設(shè)計(jì)了附加酶切位點(diǎn)的引物，酶切位點(diǎn)為Xho I、Bgl II和Sal I、Mlu I，以及質(zhì)粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4。 2.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建 經(jīng)PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pMD15-T-CSF、pMD15-T-IL-4中的目的片段GM-CSF、IL-4；利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收、瓊脂糖凝膠回收純化好的的PCR產(chǎn)物，分別在各自的酶切位點(diǎn)處進(jìn)行雙酶切，目的是回收兩條目的基因片段GM-CSF和IL-4；用T4連接酶分別與經(jīng)同步酶切的載體片段psT-ΔSG上進(jìn)行連接，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的優(yōu)勢(shì)抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建單獨(dú)表達(dá)GM-CSF、IL-4基因的重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4；將目的基因與連接片段IRES分步連接到PsT-ΔSG載體上，經(jīng)在固體培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的優(yōu)勢(shì)抗性菌落的常規(guī)篩選，構(gòu)建pGM-CSF-IRES-IL-4真核表達(dá)載體。 3.重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在CHO細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4在陽(yáng)性脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)GM-CSF、IL-4在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。 4.IFA及Elisa檢測(cè)表達(dá)情況 對(duì)轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞用IFA和Elisa檢測(cè)人源GM-CSF、IL-4基因的蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果 1.真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4的構(gòu)建 成功構(gòu)建的三種真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4和pGM-CSF-IRES-IL-4，，分別在經(jīng)菌落PCR，質(zhì)粒的PCR，瓊脂糖凝膠電泳雙酶切等方法鑒定后構(gòu)建成功。 2. IFA實(shí)驗(yàn)及Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GM-CSF、IL-4表達(dá)結(jié)果 經(jīng)過(guò)IFA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出，在熒光顯微鏡的下陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞大約在60%以上左右。Elisa的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GM-CSF、IL-4兩種基因在培養(yǎng)的CHO細(xì)胞當(dāng)中能夠成功的表達(dá)。 結(jié)論 1.成功將人源基因GM-CSF、IL-4亞克隆入psT-ΔSG，分別構(gòu)建了融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF、pIL-4以及pGM-CSF-IRES-IL-4 2.人源細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4在真核細(xì)胞中表達(dá)并鑒定正確，為構(gòu)建人源細(xì)胞因子體外永久性表達(dá)細(xì)胞系及體外激活DC/CIK奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：共表達(dá)基因 細(xì)胞因子 真核表達(dá)載體
【學(xué)位授予單位】：泰山醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-11
• 前言11-16
• 第一部分 重組表達(dá)質(zhì)粒 pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL-4 構(gòu)建16-43
• 材料與方法17-39
• 結(jié)果39-40
• 討論40-42
• 結(jié)論42-43
• 第二部分 重組表達(dá)質(zhì)粒 pGM-CSF、pIL-4、 pGM-CSF-IRES-IL- 4 在CHO 細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定43-63
• 材料與方法44-56
• 結(jié)果56-59
• 討論59-62
• 結(jié)論62-63
• 附圖63-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 綜述70-77
• 參考文獻(xiàn)74-77
• 致謝77-78
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文78

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