本文關(guān)鍵詞：hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：雪旺細(xì)胞作為周?chē)窠?jīng)工程中的核心種子細(xì)胞，在神經(jīng)修復(fù)。再生等方面發(fā)揮重要作用，而體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞，常因多次連續(xù)傳代后衰老而凋亡，最終死亡。永生化雪旺細(xì)胞具有無(wú)限傳代的功能，可解決雪旺細(xì)胞在組織工程中應(yīng)用的難題。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞以期得到永生化細(xì)胞。 方法：1.選取出生后7天左右的SD大鼠，冰凍處死后酒精浸泡消毒，取其坐骨神經(jīng)以及臂叢神經(jīng)，剪碎至1mm3大小的組織塊，，雙酶消化法進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到85%匯合密度時(shí)用低濃度胰酶快速消化傳代，30分鐘差速貼壁法進(jìn)一步純化雪旺細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并拍照。經(jīng)S100免疫熒光鑒是否為雪旺細(xì)胞。2.將純化的雪旺細(xì)胞用含hTERT基因的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染原代雪旺細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)滿80%密度時(shí)更換含G418（100ug/ml）的完全培養(yǎng)基，每3天換液1次，篩選2周，轉(zhuǎn)入含hTERT基因的質(zhì)粒的細(xì)胞經(jīng)過(guò)篩選獲得陽(yáng)性克隆后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代后的細(xì)胞經(jīng)S-100蛋白免疫熒光鑒定。3.轉(zhuǎn)染成功后的雪旺細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)染后第5、10、20、30代雪旺細(xì)胞與原代雪旺細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5代的雪旺細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用熒光定量PCR和免疫印跡Western bloting法分別檢測(cè)雪旺細(xì)中NGF、BDNF和BFGF的表達(dá)情況。 結(jié)果：1.經(jīng)雙酶消化法可以獲得大量處于增殖狀態(tài)的雪旺細(xì)胞，應(yīng)用差速貼壁傳代法后可以獲得典型的長(zhǎng)梭形放射狀肩并肩排列的雪旺細(xì)胞，光鏡視野下雪旺細(xì)胞純度可以達(dá)到90%以上，成纖維細(xì)胞量少，經(jīng)S-100蛋白免疫熒光測(cè)定鑒定為雪旺細(xì)胞。2. hTERT基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞后光學(xué)顯微鏡觀察可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞胞體體積大，呈長(zhǎng)梭形，無(wú)規(guī)則貼壁生長(zhǎng)，熒光顯微鏡下觀察見(jiàn)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無(wú)熒光，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞為綠色熒光。經(jīng)S100免疫熒光鑒定為雪旺細(xì)胞。3.通過(guò)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原代雪旺細(xì)胞中NGF mRNA的表達(dá)較培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞明顯增加，hTERT基因轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞中NGF mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)穩(wěn)定性，并且隨著傳代次數(shù)的增加，其表達(dá)逐漸降低。BDNF和BFGF mRNA表達(dá)也具有相同的情況，培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞中BDNF和BFGF mRNA表達(dá)明顯降低，而轉(zhuǎn)染初期（轉(zhuǎn)染后5、10代）其表達(dá)能力維持在穩(wěn)定水平，但隨著傳代次數(shù)的增加，其表達(dá)能力逐漸下降。上述結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。4. Western Bloting結(jié)果分析顯示，培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞中NGF蛋白表達(dá)較原代雪旺細(xì)胞明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞NGF蛋白表達(dá)與原代雪旺細(xì)胞大致相同，且均高于培養(yǎng)五代的雪旺細(xì)胞，可見(jiàn)NGF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后早期（轉(zhuǎn)染后5、10代）與晚期（轉(zhuǎn)染后20、30代）均能穩(wěn)定表達(dá)，無(wú)明顯差異（P0.05）。BDNF和BFGF蛋白表達(dá)情況基本一致，原代雪旺細(xì)胞與轉(zhuǎn)染早期（轉(zhuǎn)染后5、10代）的雪旺細(xì)胞中兩個(gè)蛋白的表達(dá)情況基本相同，并且均高于培養(yǎng)5代的雪旺細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后晚期（轉(zhuǎn)染后20、30代）的雪旺細(xì)胞，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論：1.選用7天左右的SD乳鼠作為取材的對(duì)象，其雪旺細(xì)胞的活力較好，可以獲取大量的一段時(shí)期內(nèi)增殖較快并且純化率較高的雪旺細(xì)胞。2.應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可以成功的將含hTERT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入雪旺細(xì)胞。并且該方法的得到的雪旺細(xì)胞能維持原有的形態(tài)，無(wú)腫瘤化傾向，并且具有良好的分泌功能。3.轉(zhuǎn)染成功后的雪旺細(xì)胞其增值能力增強(qiáng)，分泌NGF、BDNF、BFGF的能力也隨之增強(qiáng)，可以解決正常培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞增能力有限和分泌不足的問(wèn)題。
【關(guān)鍵詞】：hTERT 轉(zhuǎn)染 雪旺細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-22
• 1.實(shí)驗(yàn)材料12-14
• 1.1 組織來(lái)源12
• 1.2 主要藥品與試劑12-13
• 1.3 主要儀器13-14
• 2.實(shí)驗(yàn)方法14-22
• 2.1 雪旺細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)14-15
• 2.2 脂質(zhì)體法 hTERT 轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞15
• 2.3 實(shí)驗(yàn)分組15
• 2.4 免疫熒光15-16
• 2.5 熒光定量 PCR16-19
• 2.6 Western Blot19-22
• 2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析22
• 結(jié)果22-25
• 1.原代雪旺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定22-23
• 2.hTERT 基因轉(zhuǎn)染后的雪旺細(xì)胞23
• 3.免疫熒光鑒定轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞23-24
• 4. 熒光定量 PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞分泌蛋白 mRNA24-25
• 5. Western Bloting 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后雪旺細(xì)胞分泌蛋白的表達(dá)25
• 討論25-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻(xiàn)30-32
• 綜述32-43
• 參考文獻(xiàn)39-43
• 致謝43-44

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：335025