本文關鍵詞：hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細胞的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：雪旺細胞作為周圍神經(jīng)工程中的核心種子細胞，在神經(jīng)修復。再生等方面發(fā)揮重要作用，而體外培養(yǎng)的雪旺細胞，常因多次連續(xù)傳代后衰老而凋亡，最終死亡。永生化雪旺細胞具有無限傳代的功能，可解決雪旺細胞在組織工程中應用的難題。本實驗通過hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細胞以期得到永生化細胞。 方法：1.選取出生后7天左右的SD大鼠，冰凍處死后酒精浸泡消毒，取其坐骨神經(jīng)以及臂叢神經(jīng)，剪碎至1mm3大小的組織塊，，雙酶消化法進行體外分離培養(yǎng)，待細胞生長到85%匯合密度時用低濃度胰酶快速消化傳代，30分鐘差速貼壁法進一步純化雪旺細胞，用光學顯微鏡進行形態(tài)學觀察并拍照。經(jīng)S100免疫熒光鑒是否為雪旺細胞。2.將純化的雪旺細胞用含hTERT基因的質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染原代雪旺細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，待細胞生長滿80%密度時更換含G418（100ug/ml）的完全培養(yǎng)基，每3天換液1次，篩選2周，轉(zhuǎn)入含hTERT基因的質(zhì)粒的細胞經(jīng)過篩選獲得陽性克隆后繼續(xù)傳代培養(yǎng)，傳代后的細胞經(jīng)S-100蛋白免疫熒光鑒定。3.轉(zhuǎn)染成功后的雪旺細胞進行傳代培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)染后第5、10、20、30代雪旺細胞與原代雪旺細胞及未轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5代的雪旺細胞進行實驗，應用熒光定量PCR和免疫印跡Western bloting法分別檢測雪旺細中NGF、BDNF和BFGF的表達情況。 結(jié)果：1.經(jīng)雙酶消化法可以獲得大量處于增殖狀態(tài)的雪旺細胞，應用差速貼壁傳代法后可以獲得典型的長梭形放射狀肩并肩排列的雪旺細胞，光鏡視野下雪旺細胞純度可以達到90%以上，成纖維細胞量少，經(jīng)S-100蛋白免疫熒光測定鑒定為雪旺細胞。2. hTERT基因轉(zhuǎn)染雪旺細胞后光學顯微鏡觀察可見轉(zhuǎn)染后的雪旺細胞胞體體積大，呈長梭形，無規(guī)則貼壁生長，熒光顯微鏡下觀察見未轉(zhuǎn)染的細胞無熒光，轉(zhuǎn)染成功的細胞為綠色熒光。經(jīng)S100免疫熒光鑒定為雪旺細胞。3.通過熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)，原代雪旺細胞中NGF mRNA的表達較培養(yǎng)五代的雪旺細胞明顯增加，hTERT基因轉(zhuǎn)染后的雪旺細胞中NGF mRNA的表達呈現(xiàn)穩(wěn)定性，并且隨著傳代次數(shù)的增加，其表達逐漸降低。BDNF和BFGF mRNA表達也具有相同的情況，培養(yǎng)五代的雪旺細胞中BDNF和BFGF mRNA表達明顯降低，而轉(zhuǎn)染初期（轉(zhuǎn)染后5、10代）其表達能力維持在穩(wěn)定水平，但隨著傳代次數(shù)的增加，其表達能力逐漸下降。上述結(jié)果具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。4. Western Bloting結(jié)果分析顯示，培養(yǎng)五代的雪旺細胞中NGF蛋白表達較原代雪旺細胞明顯減少，具有統(tǒng)計學意義（P0.05），轉(zhuǎn)染后的雪旺細胞NGF蛋白表達與原代雪旺細胞大致相同，且均高于培養(yǎng)五代的雪旺細胞，可見NGF細胞在轉(zhuǎn)染后早期（轉(zhuǎn)染后5、10代）與晚期（轉(zhuǎn)染后20、30代）均能穩(wěn)定表達，無明顯差異（P0.05）。BDNF和BFGF蛋白表達情況基本一致，原代雪旺細胞與轉(zhuǎn)染早期（轉(zhuǎn)染后5、10代）的雪旺細胞中兩個蛋白的表達情況基本相同，并且均高于培養(yǎng)5代的雪旺細胞和轉(zhuǎn)染后晚期（轉(zhuǎn)染后20、30代）的雪旺細胞，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結(jié)論：1.選用7天左右的SD乳鼠作為取材的對象，其雪旺細胞的活力較好，可以獲取大量的一段時期內(nèi)增殖較快并且純化率較高的雪旺細胞。2.應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可以成功的將含hTERT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入雪旺細胞。并且該方法的得到的雪旺細胞能維持原有的形態(tài)，無腫瘤化傾向，并且具有良好的分泌功能。3.轉(zhuǎn)染成功后的雪旺細胞其增值能力增強，分泌NGF、BDNF、BFGF的能力也隨之增強，可以解決正常培養(yǎng)的雪旺細胞增能力有限和分泌不足的問題。
【關鍵詞】：hTERT 轉(zhuǎn)染 雪旺細胞
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-12
• 材料與方法12-22
• 1.實驗材料12-14
• 1.1 組織來源12
• 1.2 主要藥品與試劑12-13
• 1.3 主要儀器13-14
• 2.實驗方法14-22
• 2.1 雪旺細胞的原代分離培養(yǎng)14-15
• 2.2 脂質(zhì)體法 hTERT 轉(zhuǎn)染雪旺細胞15
• 2.3 實驗分組15
• 2.4 免疫熒光15-16
• 2.5 熒光定量 PCR16-19
• 2.6 Western Blot19-22
• 2.7 統(tǒng)計學分析22
• 結(jié)果22-25
• 1.原代雪旺細胞的形態(tài)學觀察及鑒定22-23
• 2.hTERT 基因轉(zhuǎn)染后的雪旺細胞23
• 3.免疫熒光鑒定轉(zhuǎn)染后雪旺細胞23-24
• 4. 熒光定量 PCR 檢測轉(zhuǎn)染后雪旺細胞分泌蛋白 mRNA24-25
• 5. Western Bloting 檢測轉(zhuǎn)染后雪旺細胞分泌蛋白的表達25
• 討論25-29
• 結(jié)論29-30
• 參考文獻30-32
• 綜述32-43
• 參考文獻39-43
• 致謝43-44

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關鍵詞：hTERT基因轉(zhuǎn)染大鼠雪旺細胞的實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：335025