本文關(guān)鍵詞：鳥(niǎo)分枝桿菌的分離鑒定及PhoR基因表達(dá)和蛋白功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的： 非結(jié)核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）所感染的疾病在日益流行的AIDS/HIV病患中不斷涌現(xiàn)。因其臨床表現(xiàn)與結(jié)核病極其相似，早期診斷易出現(xiàn)誤診、漏診。研究開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確的分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)對(duì)NTM病早期診斷與及時(shí)治療具有重要意義。鳥(niǎo)分枝桿菌復(fù)合體（Mycobacterium avium complex，MAC）在AIDS/HIV患者NTM病中所占比例甚大。為更好地了解、研究AIDS/HIV患者中的NTM持留存活機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用16S rRNA測(cè)序法對(duì)15例來(lái)自AIDS/HIV患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行鑒定得到鳥(niǎo)分枝桿菌，并初步探究鳥(niǎo)分枝桿菌PhoR基因功能。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、鳥(niǎo)分枝桿菌的分離鑒定 本實(shí)驗(yàn)采用16S rRNA測(cè)序法對(duì)15例來(lái)自AIDS/HIV患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行鑒定 2、鳥(niǎo)分枝桿菌PhoR基因的原核表達(dá) 檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得鳥(niǎo)分枝桿菌104菌株P(guān)hoR基因序列，在其兩側(cè)加入BamH I和EcoR I酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將膠回收的PCR產(chǎn)物與pGEX-4T-3表達(dá)載體雙酶切處理，T4連接酶連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-3-PhoR，PCR與雙酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接比對(duì)后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，隨后pGEX-4T-3-PhoR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，菌體破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。 3、PhoR基因原核表達(dá)對(duì)重組菌在三種耐受條件下生存影響 大腸桿菌BL21(DE3)和含pGEX-4T-3質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)分別在SDS、NaNO2及H2O2條件下進(jìn)行耐受閾值實(shí)驗(yàn)，確定各自最大耐受閾值。將IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)2h的重組菌BL/pGEX-4T-3-PhoR和BL/pGEX-4T-3，用LB培養(yǎng)液調(diào)整至OD600為0.8后，分別進(jìn)行大腸桿菌在0.4%SDS、7mmol/L NaNO2及1mmol/L H2O2耐受條件下的生存影響實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、鳥(niǎo)分枝桿菌的分離鑒定 15例分枝桿菌中有9株結(jié)核分枝桿菌、4株鳥(niǎo)分枝桿菌、2株膿腫分枝桿菌。測(cè)序結(jié)果中顯示有四條序列完全一樣，長(zhǎng)度為496bp。NCBIBLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與鳥(niǎo)分枝桿菌104菌株16S rRNA序列基本一樣，只在序列的第81位存在差異，判斷其為鳥(niǎo)分枝桿菌。 2、鳥(niǎo)分枝桿菌PhoR基因的原核表達(dá) 采用溫度梯度PCR法擴(kuò)增PhoR基因，條帶大小約為1500bp，與預(yù)計(jì)大小基本相符。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-PhoR經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空載對(duì)照組，出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，與預(yù)期GST標(biāo)簽蛋白條帶(26.8kD)接近。重組質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)組表達(dá)的融合蛋白大小約為85kD，，比預(yù)期蛋白大小77.6kD略微偏大。 3、PhoR基因原核表達(dá)對(duì)重組菌在三種耐受條件下生存影響 （1）在0.4%SDS耐受條件下，實(shí)驗(yàn)組BL/pGEX-4T-3-PhoR與空載對(duì)照組BL/pGEX-4T-3細(xì)菌生長(zhǎng)情況一樣，均無(wú)法存活。 （2）在7mmol/L NaNO2耐受條件下，實(shí)驗(yàn)組BL/pGEX-4T-3-PhoR能夠繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，而空載質(zhì)粒組基本無(wú)法存活。 （3）在1mmol/L H2O2耐受條件下，實(shí)驗(yàn)組BL/pGEX-4T-3-PhoR仍然可以生長(zhǎng)繁殖，而空載質(zhì)粒組基本無(wú)法存活。 結(jié)論： （1）成功從15例AIDS/HIV患者痰培養(yǎng)陽(yáng)性的樣本中分離鑒定出一株鳥(niǎo)分枝桿菌104菌株。 （2）成功構(gòu)建了pGEX-4T-3-PhoR重組表達(dá)質(zhì)粒。 （3）PhoR基因表達(dá)對(duì)大腸桿菌在SDS最大耐受閾值條件下耐受存活無(wú)作用。 （4）PhoR基因表達(dá)有助于大腸桿菌在NaNO2和H2O2最大耐受閾值條件下耐受存活。
【關(guān)鍵詞】：非結(jié)核分枝桿菌 分離鑒定 鳥(niǎo)分枝桿菌 PhoR 肺部表面活性物質(zhì) 活性氧 活性氮
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.911;Q78
【目錄】：

• 英文縮略語(yǔ)表5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-17
• 第一章 鳥(niǎo)分枝桿菌的分離鑒定17-22
• 1 材料與試劑17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-20
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-22
• 第二章 鳥(niǎo)分枝桿菌 PhoR 基因的原核表達(dá)22-38
• 1 材料與試劑22-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-30
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-38
• 第三章 PhoR 基因原核表達(dá)對(duì)宿主菌耐受不良環(huán)境功能研究38-41
• 1 材料與試劑38
• 2 實(shí)驗(yàn)方法38-39
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-41
• 討論41-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 課題綜述50-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 致謝61-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄62

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 李俊明;朱道銀;;結(jié)核分支桿菌感染與巨噬細(xì)胞的凋亡[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

2 馬s

本文編號(hào)：334388