本文關鍵詞：鳥分枝桿菌的分離鑒定及PhoR基因表達和蛋白功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的： 非結核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）所感染的疾病在日益流行的AIDS/HIV病患中不斷涌現(xiàn)。因其臨床表現(xiàn)與結核病極其相似，早期診斷易出現(xiàn)誤診、漏診。研究開發(fā)快速準確的分枝桿菌菌種鑒定技術對NTM病早期診斷與及時治療具有重要意義。鳥分枝桿菌復合體（Mycobacterium avium complex，MAC）在AIDS/HIV患者NTM病中所占比例甚大。為更好地了解、研究AIDS/HIV患者中的NTM持留存活機制，本實驗采用16S rRNA測序法對15例來自AIDS/HIV患者痰培養(yǎng)陽性標本進行鑒定得到鳥分枝桿菌，并初步探究鳥分枝桿菌PhoR基因功能。 實驗方法： 1、鳥分枝桿菌的分離鑒定 本實驗采用16S rRNA測序法對15例來自AIDS/HIV患者痰培養(yǎng)陽性標本進行鑒定 2、鳥分枝桿菌PhoR基因的原核表達 檢索NCBI數(shù)據庫獲得鳥分枝桿菌104菌株PhoR基因序列，在其兩側加入BamH I和EcoR I酶切位點，設計并合成引物后進行PCR擴增；將膠回收的PCR產物與pGEX-4T-3表達載體雙酶切處理，T4連接酶連接轉化，構建重組質粒pGEX-4T-3-PhoR，PCR與雙酶切驗證正確后測序。測序結果經拼接比對后進行生物信息學分析，隨后pGEX-4T-3-PhoR重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導，菌體破碎后進行SDS-PAGE電泳分析。 3、PhoR基因原核表達對重組菌在三種耐受條件下生存影響 大腸桿菌BL21(DE3)和含pGEX-4T-3質粒的大腸桿菌BL21(DE3)分別在SDS、NaNO2及H2O2條件下進行耐受閾值實驗，確定各自最大耐受閾值。將IPTG誘導培養(yǎng)2h的重組菌BL/pGEX-4T-3-PhoR和BL/pGEX-4T-3，用LB培養(yǎng)液調整至OD600為0.8后，分別進行大腸桿菌在0.4%SDS、7mmol/L NaNO2及1mmol/L H2O2耐受條件下的生存影響實驗。 實驗結果： 1、鳥分枝桿菌的分離鑒定 15例分枝桿菌中有9株結核分枝桿菌、4株鳥分枝桿菌、2株膿腫分枝桿菌。測序結果中顯示有四條序列完全一樣，長度為496bp。NCBIBLAST比對發(fā)現(xiàn)，其與鳥分枝桿菌104菌株16S rRNA序列基本一樣，只在序列的第81位存在差異，判斷其為鳥分枝桿菌。 2、鳥分枝桿菌PhoR基因的原核表達 采用溫度梯度PCR法擴增PhoR基因，條帶大小約為1500bp，與預計大小基本相符。構建重組表達質粒pGEX-4T-3-PhoR經測序驗證后進行原核表達，SDS-PAGE實驗結果顯示空載對照組，出現(xiàn)清晰的蛋白條帶，與預期GST標簽蛋白條帶(26.8kD)接近。重組質粒實驗組表達的融合蛋白大小約為85kD，，比預期蛋白大小77.6kD略微偏大。 3、PhoR基因原核表達對重組菌在三種耐受條件下生存影響 （1）在0.4%SDS耐受條件下，實驗組BL/pGEX-4T-3-PhoR與空載對照組BL/pGEX-4T-3細菌生長情況一樣，均無法存活。 （2）在7mmol/L NaNO2耐受條件下，實驗組BL/pGEX-4T-3-PhoR能夠繼續(xù)生長繁殖，而空載質粒組基本無法存活。 （3）在1mmol/L H2O2耐受條件下，實驗組BL/pGEX-4T-3-PhoR仍然可以生長繁殖，而空載質粒組基本無法存活。 結論： （1）成功從15例AIDS/HIV患者痰培養(yǎng)陽性的樣本中分離鑒定出一株鳥分枝桿菌104菌株。 （2）成功構建了pGEX-4T-3-PhoR重組表達質粒。 （3）PhoR基因表達對大腸桿菌在SDS最大耐受閾值條件下耐受存活無作用。 （4）PhoR基因表達有助于大腸桿菌在NaNO2和H2O2最大耐受閾值條件下耐受存活。
【關鍵詞】：非結核分枝桿菌 分離鑒定 鳥分枝桿菌 PhoR 肺部表面活性物質 活性氧 活性氮
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911;Q78
【目錄】：

• 英文縮略語表5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-17
• 第一章 鳥分枝桿菌的分離鑒定17-22
• 1 材料與試劑17
• 2 實驗方法17-20
• 3 實驗結果20-22
• 第二章 鳥分枝桿菌 PhoR 基因的原核表達22-38
• 1 材料與試劑22-24
• 2 實驗方法24-30
• 3 實驗結果30-38
• 第三章 PhoR 基因原核表達對宿主菌耐受不良環(huán)境功能研究38-41
• 1 材料與試劑38
• 2 實驗方法38-39
• 3 實驗結果39-41
• 討論41-45
• 結論45-46
• 參考文獻46-50
• 課題綜述50-61
• 參考文獻58-61
• 致謝61-62
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前5條

1 李俊明;朱道銀;;結核分支桿菌感染與巨噬細胞的凋亡[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2006年01期

2 馬s

本文編號：334388