本文關(guān)鍵詞：沙門氏菌FliT-FliD蛋白復(fù)合物及大腸桿菌O157:H7 Z0021蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鞭毛位于細(xì)菌的表面,是細(xì)菌主要的運(yùn)動(dòng)器官。自然界中,通過鞭毛的推動(dòng)作用細(xì)菌能逃離不利的環(huán)境,到達(dá)營養(yǎng)更豐富、更利于其生存的環(huán)境中。有些腸道致病菌在鞭毛的推動(dòng)作用下,能很快的吸附到上皮細(xì)胞表面,進(jìn)入血液,使宿主致病。因此,越來越多的新型抗菌藥物都選擇鞭毛的合成途徑作為靶點(diǎn)。 細(xì)菌鞭毛的合成是一個(gè)自組裝的過程。它是由一系列的蛋白組成的一個(gè)大的蛋白質(zhì)復(fù)合體。與鞭毛合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯都有著嚴(yán)格的調(diào)控。按照基因的轉(zhuǎn)錄順序,鞭毛基因被分為三類：第一級、第二級以及第三級鞭毛基因。flhDC操縱子處于整個(gè)鞭毛基因轉(zhuǎn)錄翻譯的最上游,首先被翻譯出來。此操縱子翻譯出來的FlhD和FlhC兩個(gè)蛋白能組裝成異源蛋白六聚體FlhD4C2。FlhD4C2復(fù)合物是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,能促進(jìn)第二級鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄。二級鞭毛基因主要表達(dá)基體、鉤形鞘蛋白及鞭毛特異性轉(zhuǎn)錄因子628。三級鞭毛基因主要負(fù)責(zé)鞭毛蛋白、一些調(diào)控蛋白及一些未知功能蛋白的表達(dá)。 鞭毛蛋白的表達(dá)和組裝過程受不同層次上很多因子的調(diào)控。鞭毛基因的調(diào)控涉及到DNA水平、mRNA水平及蛋白水平,FlhD4C2復(fù)合體是鞭毛合成調(diào)控的重要位點(diǎn)。本文的研究對象FliT是在蛋白水平上調(diào)控FlhDC功能的蛋白。 FliT是一種鞭毛特異性的分子伴侶,它能特異性地結(jié)合FliD,一方面抑制FliD在細(xì)胞質(zhì)中的聚沉,另一方面促進(jìn)FliD的運(yùn)輸。FliT還可以和FlhDC復(fù)合體相互作用,抑制鞭毛基因的表達(dá)。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下： (1)確定FliD與FliT作用的最小區(qū)域。為了找到與F1iT相互作用的最小FliD片段,我們克隆了四個(gè)FliD片段：FliD1-115aa、FliD1-215aa、FliD115-end、215-end。通過pull down,我們將與FliT作用的區(qū)域確定為FliDC端的210個(gè)氨基酸殘基。 (2)獲得FliT與FliD的蛋白復(fù)合物晶體。我們共轉(zhuǎn)了FliT94與FliD(215-end),得到含有可同時(shí)表達(dá)FliD和FliT蛋白的菌株。通過離子交換柱、分子篩純化蛋白,冰上用胰蛋白酶消化蛋白復(fù)合體30min,篩晶體得到了FliT與FliD的蛋白復(fù)合物晶體。 (3)確定FliT與FliD、 FlhDC作用的氨基酸。我們克隆了FliT的5個(gè)點(diǎn)突變體：F7S、W11S、W30S、Y40S、Y67S。通過pull down,我們發(fā)現(xiàn)W30S突變體不能再和FliD結(jié)合,由此,我們得知FliT30位的色氨酸參與其與FliD的相互作用。用同樣的方法,我們遺憾地發(fā)現(xiàn)5個(gè)點(diǎn)突變體都還能繼續(xù)與FlhDC結(jié)合。 本課題的另一部分是關(guān)于大腸桿菌0157：H7中Z0021蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究。大腸桿菌0157：H7是一種胃腸病原體,能引發(fā)人體多種疾病。Z0021基因位于OI-1菌毛編碼區(qū),是一種新發(fā)現(xiàn)的鞭毛合成抑制因子。敲除Z0021基因后,大腸桿菌0157：H7細(xì)菌表面鞭毛數(shù)量增加,移動(dòng)性顯著增強(qiáng)。相反,如果過表達(dá)Z0021基因,就會(huì)抑制細(xì)菌移動(dòng)。通用轉(zhuǎn)錄報(bào)告系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)Z0021蛋白不影響FlhDC的轉(zhuǎn)錄翻譯,但影響二級三級基因的轉(zhuǎn)錄。在Z0021過表達(dá)的菌株中,FlhD4C2表達(dá)水平也隨之上調(diào)。我們嘗試通過純化結(jié)晶的方法得到Z0021蛋白的結(jié)構(gòu),并解釋其對細(xì)菌移動(dòng)性的抑制機(jī)理。SignalP4.1Server預(yù)測發(fā)現(xiàn)Z0021的前18位氨基酸可能是信號肽。我們構(gòu)建了Z0021-pGEX和Z0021-23-end-pGEX克隆,通過細(xì)菌移動(dòng)性實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)Z0021的全長蛋白和片段23-end均能抑制細(xì)菌移動(dòng)性。由此,我們推測Z0021發(fā)揮功能的區(qū)域可能是細(xì)胞質(zhì)而非周質(zhì)空間。
【關(guān)鍵詞】：鞭毛 FliT FliD ZOO21 細(xì)菌移動(dòng)性
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符號說明10-11
• 第一章 前言11-23
• 1.1 細(xì)菌鞭毛簡介11-16
• 1.1.1 鞭毛的合成和組裝12-14
• 1.1.2 鞭毛合成的調(diào)控14-15
• 1.1.3 鞭毛的運(yùn)動(dòng)性和生物膜15
• 1.1.4 鞭毛基因第一級表達(dá)產(chǎn)物FlhD4C2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展15-16
• 1.2 沙門氏菌FliT、FliD蛋白的介紹16-18
• 1.3 大腸桿菌O157：H7 Z0021蛋白的介紹18-20
• 1.4 晶體結(jié)構(gòu)的解析20-22
• 1.4.1 X射線的產(chǎn)生20
• 1.4.2 X射線衍射原理20-22
• 1.5 本課題的研究內(nèi)容22-23
• 第二章 stFliD與stFliT94作用最小片段的確定23-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法23-28
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.1.2 儀器設(shè)備24
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 2.1.3.1 構(gòu)建表達(dá)載體24-27
• 2.1.3.2 構(gòu)建FliT94和FliD共表達(dá)菌株27
• 2.1.3.3 蛋白質(zhì)過表達(dá)與純化27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-29
• 2.2.1 stFliDl-116aa、stFliD1-215aa、stFliD215-end的蛋白純化28
• 2.2.2 確定與stFliT94作用的stFliD最小片段28-29
• 2.3 本章小結(jié)29-31
• 第三章 stFliT94-stFliD215-end蛋白復(fù)合物的純化結(jié)晶31-41
• 3.1 實(shí)驗(yàn)方法與步驟31-32
• 3.1.1 蛋白復(fù)合物的純化結(jié)晶31
• 3.1.2 胰蛋白酶酶切條件的摸索31-32
• 3.1.3 胰蛋白酶酶解產(chǎn)物大量純化實(shí)驗(yàn)32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-40
• 3.2.1 stFliT94-stFliD(215-end)蛋白純化結(jié)晶32-34
• 3.2.2 stFliT94-stF1iD(215-end)no-tag蛋白復(fù)合物純化結(jié)晶34-37
• 3.2.3 stFliT94-stFliD(215-end)胰蛋白酶切蛋白復(fù)合物的純化37-39
• 3.2.4 stFliT94-stFliD(215-end)蛋白復(fù)合體結(jié)晶條件篩選和晶體優(yōu)化39-40
• 3.3 本章小結(jié)40-41
• 第四章 stFliT與stFliD、stFlhD_4C_2相互作用研究41-49
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器41-42
• 4.1.1 菌株及載體41
• 4.1.2 儀器與試劑41-42
• 4.2 具體實(shí)驗(yàn)步驟42-44
• 4.2.1 stFliT突變體的構(gòu)建及突變體蛋白純化42-43
• 4.2.2 Pull down實(shí)驗(yàn)步驟43-44
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-48
• 4.3.1 stFliT突變體蛋白純化44-45
• 4.3.2 stFliT-stFliD pull down實(shí)驗(yàn)45-47
• 4.3.3 stFliT-stFlhDC復(fù)合物pull down實(shí)驗(yàn)47-48
• 4.4 本章小結(jié)48-49
• 第五章 大腸桿菌O157：H7 Z0021蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究49-61
• 5.1 Z0021蛋白背景介紹49-51
• 5.2 Z0021蛋白基本信息51-52
• 5.3 實(shí)驗(yàn)材料和方法52-54
• 5.3.1 菌株及載體52
• 5.3.2 試劑和儀器52
• 5.3.3 基因的克隆52-54
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-60
• 5.4.1 Z0021蛋白純化54-59
• 5.4.2 Z0021蛋白對細(xì)菌移動(dòng)性的影響59-60
• 5.5 本章小結(jié)60-61
• 全文總結(jié)61-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 致謝67-69
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表69

【共引文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：沙門氏菌FliT-FliD蛋白復(fù)合物及大腸桿菌O157:H7 Z0021蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：334098